表皮生长因子信号复合体的亚细胞空间动态组装研究

Epithelial growth factor receptor (EGFR) is the prototypic member of ErbB family receptor tyrosine kinases (RTKs). Signaling pathways governed by EGFR controls numerous essential cellular processes, including proliferation, differentiation and migration. EGFR overexpression and functional abnormality are shown to be the main driver for many types of neoplasm including lung, breast, colon, and cervical cancer, making EGFR one of the most important drug targets. Upon activation, EGFR and its binding partners quickly undergo internalization through several endocytotic routes to localize to various intracellular compartments, including early and late endosome, lysosome, ER and nucleus. Recent studies suggest, however, differentially localized EGFR signaling complex may dynamically recruit distinct components to activate specific downstream pathways, and thus specific biological outputs. Moreover, increasing number of cancers has been found to associate with abnormal EGFR endocytosis. Nevertheless, in-depth analysis at the global level on the spatial regulation of EGFR signaling complex assembly is still missing. In this application, we propose, by integrating several modern techniques in molecular cell biology with advanced quantitative mass spectrometry, to comprehensively explore the spatial aspect of EGFR-mediated signaling network regulation. Specifically, we will take advantage of our previously established EGFR-specific quantitative mass spectrometry workflow to study how EGFR signaling complexes are differentially assembled over the course of its intercellular trafficking upon activation and the underling biological significance. The result should shed light for novel strategies in disease diagnosis, overcoming drug resistance, and developing new therapeutics.

细胞表面受体通过组装多因子信号复合体实现外界激活信号的胞内转导与调控。 此过程中复合体组成成分及翻译后修饰状态等往往在全细胞范围内存在复杂、连续的动态调控，以确保细胞在正确时间与地点激活相应信号通路。受技术手段限制，目前对信号复合体组装的动态变化规律还缺乏系统水平的了解。表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号转导控制着细胞生长和迁移等重要过程，与多种癌症的发生发展密切相关。激活后，位于质膜的EGFR在Shc1等脚手架蛋白介导下组装特异性信号复合体，并激活MAPK与PI3K等通路。之后其通过内吞作用先后定位于内吞体等亚细胞空间，以激活不同下游信号通路。本项目拟以EGFR为研究模型，发展基于定量质谱技术的信号复合体时空动态研究新方法与策略，并从复合体动态组装的角度分析EGFR介导的信号转导机制。此研究不仅为EGFR相关肿瘤的防治提供新策略与靶标，更可为各类信号复合体的动态调控研究奠定基础。

蛋白质复合体是细胞的功能单位，也是细胞信号转导网络的分子基础，与细胞的行为紧密相关。与相对恒定的基因组和单体蛋白质相比，蛋白质复合体组成随着细胞环境与功能变化而变化。但目前有效捕捉蛋白质复合体时空动态变化的方法还很有限。为此，本课题设立了以ERBB蛋白复合体为模版，发展一种在全细胞范围检测天然蛋白质复合体时空动态的技术流程的目标，并主要进行了下列研究：.1）磷酸化酪氨酸（pTyr）常被用于介导蛋白质复合体组装，也直接反映病生理条件下胞内相应激酶活性。我们发展了一种简单、高效的pTyr多肽富集方法，提高了鉴定效率，尤其适用于在原代细胞和组织等低丰度pTyr样品,为预测蛋白质复合体及信号通路动态变化打下基础。.2）发展了一种可在各类细胞与组织样品中对天然蛋白质复合体在全细胞范围进行动态测定的方法流程，包括亚细胞器分离与细胞器标志物系统筛查、微量样品中的复合体纯化以及基于PRM方法的复合体动力学测定。将此法应用于ERBB受体复合体研究，发现不同亚细胞器定位的ERBB复合体成分存在显著差异。其中值得注意的是活化后ERBB可在胞浆中诱导产生一种不含受体的游离型复合体。该机制可能是一种广泛存在的调控方式，用于扩大受体信号转导范围。.3）在完成既定研究目标前提下，ERBB蛋白质复合体差异性组装启发我们探索其肿瘤特异性组装。在一组泛癌细胞中，我们利用PRM质谱技术定量了ERBB复合体成分在不同激活条件下的变化，证实其同样具有高度肿瘤细胞特异性。通过将复合体分子特征与355种肿瘤靶向药物敏感性进行关联，证明这种特异性组装具明显规律性，且以功能模块方式进行。同一功能模块的组装与药物敏感性具有相关联。进一步利用TCGA临床数据，发现两种与乳腺癌患者预后显著相关的分子组合。.本课题产出SCI文章1篇，在投文章3篇。培养副高人才1名，硕士研究生5名，本科毕业生8名。本课题不仅为蛋白质复合体研究提供了新思路与方法，也鉴定了潜在的临床标志物，具有重要理论与社会经济价值。