胞质NPM突变蛋白调控TRAF6介导的AKT泛素化激活在急性髓系白血病中的作用

Nucleophosmin 1 (NPM1) is the most commonly mutated gene in acute myeloid leukemia (AML). Mutations leading to aberrant cytoplasmic localization of nucleophosmin (NPMc+) is the main characteristics in all cases of AML with mutated NPM1. During the previous project (No: 30872418), we found that NPM1 mutations involved in regulation of cell proliferation and resistance to apoptosis, yet their role in leukemogenesis remains obscure. The PI3K/AKT signaling module is an important mediator of cytokine signaling implicated in regulation of hematopoiesis. Several changes in the expression of AKT and its downstream effector FOXO3a have been correlated to clinical outcome of AML patients. TRAF6 was found to be a only direct E3 ligase for Akt. The overexpression of TRAF6 in TRAF6-chimeric mice induces AML. The previous study shows that NPMc+ interacts with AKT and inhibits the level of AKT phosphorylation and ubiquitination. However, the molecular mechanism by which the activity of AKT is regulated by NPMc+ remains largely unknown. Here we hypothesize that NPMc+ regulates Akt activation by modulating TRAF6-mediated Akt ubiquitnation, therefore participates in AKT/FOXO3a mediated leukemia cell differentiation and drug sensitive. Our proposal, if proven right, will not only reveal novel insights into the molecular role of NPMc+ in leukemogenesis, but also suggest a novel paradigm and therapeutic target for NPMc+ AML.

核仁磷酸蛋白（NPM1）突变是急性髓系白血病（AML）中最常见的基因突变，胞质NPM突变蛋白（NPMc+）是伴NPM1突变AML最显著的特征。前一个项目我们发现NPMc+促进白血病细胞增殖和抵抗凋亡，但是NPMc+调控AML恶性表型的分子机制并未阐明。PI3K/AKT信号通路是介导细胞因子调节造血的中央枢纽，AKT及下游靶标FOXO3a与白血病预后密切相关。TRAF6是目前唯一可泛素化激活AKT的E3连接酶，参与AML发生。前期研究我们发现NPMc+与AKT结合，抑制AKT磷酸化活性和泛素化修饰，但具体机制不清楚。为此我们提出NPMc+通过影响TRAF6对AKT的泛素化修饰来调控AKT/FOXO3a通路的假设，借以阐明NPMc+在AML细胞分化和药物敏感性等表型中的重要作用。本项目不仅有助于阐明NPMc+在白血病发生中的分子作用，而且为NPMc+ AML提供了一个崭新的研究模式和治疗靶点。

急性髓系白血病（AML）是细胞遗传学和分子生物学具有高度异质性的一种疾病。核仁磷酸蛋白（NPM1）突变是迄今成人AML中最常见的基因突变，由于其独特的生物学和临床特征，在2016年最新的WHO分型中NPM1突变的AML被列为一种独特的白血病亚型。NPM1基因突变导致NPM突变蛋白异常的胞质定位（NPMc+）是NPM1突变AML细胞主要的生物学特征。目前发现了60余种NPM突变类型，其中以NPM1 A型突变体（NPM mutant A，NPM1-mA）最常见。前一个项目中我们发现NPM1-mA促进白血病细胞的体外增殖和抵抗凋亡，但是NPM1-mA调控白血病恶性转化的分子机制并未完全阐明。本项目首先证实了NPM突变白血病细胞高表达AKT及其下游靶分子FOXO3a，通过过表达或者干扰技术证实了NPM1-mA能够激活白血病细胞AKT/FOXO3a信号通路。Co-IP实验和免疫荧光检测进一步证实了OCI-AML3白血病细胞中NPM1-mA蛋白能够与AKT蛋白的PH结构域相互作用，NPM1-mA蛋白与AKT共同定位在白血病细胞的胞质部分。分析NPM1-mA促进AKT激活的分子机制，TRAF6，一种已知的E3泛素连接酶，能够与白血病细胞AKT结合并泛素化激活AKT分子。in vivo蛋白质泛素化实验发现NPM1-mA不能调控TRAF6介导的AKT泛素化水平，但是，NPM1-mA能够与泛素化激活后的AKT分子结合，促进AKT分子的细胞膜转位，从而有助于AKT的磷酸化活性。其次，我们证实了NPM1-mA通过增强AKT磷酸化活性来促进白血病细胞的体外增殖。我们发现NPM1-mA可通过miR-10b/KLF4轴来抑制白血病细胞的体外髓系分化，证实了NPM突变通过抑制NF-κB活性和调控凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达来增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。最后，我们发现NPM1-mA通过Ras/ERK MAPK 信号通路上调MMPs来促进白血病细胞的体外迁移浸润。本项目不仅有助于阐明NPMc+在白血病发生中的分子作用，而且为NPMc+ AML提供了一个崭新的研究模式和治疗靶点。