肿瘤浸润性TIGIT+Treg细胞在原发性肝癌中的免疫学功能及相关miRNAs对其调控机制的研究

Tumor infiltrating Tregs cause the development of the carcinoma when its numbers and functions misconduct. We recently discoverd a novel TIGIT+Tregs in GlioBlastoma Multiform (GBM), its numbers and functions had been distroied. We hypothesized that the TIGIT+Tregs must play a critical role during the development of the carcinoma. Therefore, this project plans to investigate the expression of the Tumor infiltrating Tregs and its secretion of relative cytokines from the liver primary carcinoma by IHC, IF, Luminex and Flow Cytometry sorting and analysis, and then to evaluate its suppressive function with effector T cells. In order to assess the biological function of TIGIT+Tregs, the telomere length and the FOXP3 methylation of the TIGIT+Tregs are examined. Furthermore, to screen the specific miRNAs for those targeted TIGIT+Tregs by regulating the expression of FoxP3/TIGIT signal pathway through the Bioinformatics, RT-PCR, Dual Luciferase Reporter and Western Blot. For paving the basic foundation to screen the novel therapeutic target and elucidate the immunologic mechanism of the liver primary carcinoma.

肿瘤浸润性Treg细胞数量和功能异常会导致肿瘤的发生和发展。我们近期在多形性胶质母细胞瘤中发现一群新的数量和功能异常的TIGIT+Treg细胞亚群，推测其在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。为此，本项目拟通过免疫组化、免疫荧光、Luminex多重细胞因子检测和流式细胞的分选和分析技术观察原发性肝癌中浸润性TIGIT+Treg细胞的定位、数量及对效应性T细胞抑制作用，评价其免疫学功能；通过检测端粒酶长度和FOXP3 甲基化程度评价其生物学功能。进一步利用生物信息学技术筛选靶向调控TIGIT+Treg细胞特异的miRNAs分子，通过Real-time PCR、双荧光素酶报告基因和Western Blot等技术鉴定其在TIGIT+Treg细胞中的表达及其对FoxP3/TIGIT分子的调控，为阐明肿瘤浸润性TIGIT+Treg参与原发性肝癌发病的免疫学机制及筛选新的药物靶点提供理论依据。

本课题探讨了TIGIT在人原发性肝癌患者组织和外周血淋巴细胞中的表达及其生物学功能；探讨了调控TIGIT的作用机制，构建miRNAs靶向TIGIT基因质粒，建立TIGIT过表达稳定Jurkat T细胞株模型，研究了TIGIT及miR-206对肝癌细胞及T细胞生物学功能的影响以及TIGIT高亲和力配体CD155对肝癌细胞生物学功能的影响。应用免疫组织化学技术和实时荧光定量PCR技术检测77例原发性肝癌患者组织中Tigit、CD4、CD155的表达（癌组织73例，癌旁组织47例），分析其与临床病理特征的相关性；应用流式细胞术检测31例HCC患者手术前后、30例健康体检者外周血单个核细胞表面（主要是CD4+T、Treg细胞）TIGIT的表达，分析其临床意义；应用液相芯片技术检测血浆中炎性细胞因子在人原发性肝癌患者中的临床意义；应用q-PCR检测了TIGIT相关miRNAs在HCC中的表达水平；通过qPCR及W-B检测TIGIT的mRNA及蛋白水平的变化；应用CCK-8、划痕、Transwell实验和Western Blot探讨了TIGIT及CD155对肝癌细胞及T细胞的生物学功能的影响及作用机制。 实验结果表明：TIGIT、CD155的mRNA和蛋白水平在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，随着肿瘤细胞分化程度由高到低，在肝癌组织中TIGIT表达逐渐增加；TIGIT+CD4+T细胞，TIGIT+Treg细胞频数在HCC中明显增高，这两类细胞频数与AFP均呈正相关；与HCC患者术前炎性细胞因子的分泌水平相比，术后HCC患者血浆中促炎性细胞因子IL-17a表达升高，IL-6表达升高，抑炎性细胞因子IL-10表达减少；TIGIT相关miRNAs（miR-206）在HCC患者外周血单个核细胞中表达水平显著低于正常对照组，且与TIGIT+Treg细胞的频数呈负相关；成功构建了靶向miR-206的TIGIT重组质粒，验证了mir-206可以负向调控TIGIT的表达。利用siRNA技术将TIGIT的表达敲低以后，会影响肝癌细胞系的生物学功能：与对照组相比，si-TIGIT组抑制肝癌细胞系的迁移和侵袭而促进凋亡；肝癌细胞系经miR-206感染后，其增殖、迁移和侵袭能力降低，而凋亡能力增强；裸鼠体内实验表明 miR-206能够抑制肿瘤的生长，其机制为抑制肝癌细胞的增殖促进肝癌细胞的凋亡。