肿瘤靶向抗CDK4胞内抗体抑制肿瘤转移的作用效能及分子调控机制

Tumor metastasis is the primary cause of death for most cancer patients. Therefore, there is a pressing need to develop new therapeutic strategies. CDK4 is the first activated cyclin-dependent kinase when the cells enter the proliferating cycle. CDK4 has been a potential target for cancer therapy as its overexpression and over activation in many human cancers is required for tumorigenesis, tumor maintainence, and tumor metastasis. The applicant’s group has developed a tumor-specific intrabody against human CDK4 with inhibitory role for tumor growth both in vitro and in vivo. However, the inhibitory role and underlying molecular mechanism of the intrabody aginst CDK4 in tumor metastasis has been not clear. In order to address the above questions, in the proposed study, the inhibitory role of anti-CDK4 intrabody in vitro and in vivo will be investigated by tumor cell migration and invasiveness assy, xenograft and orthotopic tumor metastasis assay. On the other hand, by using protein interactomics and differential proteomics, we will explore how the intrabody affects the CDK4 interactome and further changes the signaling pathway mediated by CDK4. Then we will construct the molecular network by which the intrabody inhibits the tumor growth and metastasis. Finally, The role and molecular mechanisms of anti-CDK4 intrabody will be clarified. Knowledge gained from the proposed studies will provide new ideas for clinical therapy of tumor metastasis and lay the foundation for this new type intrabody to access the clinical application.

肿瘤转移是引起癌症患者死亡的首要因素,寻找新的防治肿瘤转移的有效方法及其机制研究，具有重要的科学价值和现实意义。CDK4是细胞进入增殖周期第一个被激活的周期蛋白依赖性蛋白激酶，它的过度表达、活化与多种肿瘤的发生、发展、预后及转移密切相关，是肿瘤防治的一个重要靶点。前期研究发现，申请人课题组首次以CDK4为靶点，自主研制的肿瘤靶向抗CDK4胞内抗体能够在体内外有效抑制肿瘤的生长，但该抗体能否有效抑制肿瘤转移及其分子机制尚不清楚。鉴于此，本课题通过肿瘤细胞体外迁移、侵袭实验及动物转移模型研究，明确该抗体体内外抑制肿瘤转移效能，进而结合蛋白质相互作用组学和差异蛋白质组学方法, 分析该抗体对CDK4相互作用组及其介导的相关信号通路的影响，建立该抗体抑制肿瘤转移的分子调控网络，最后明确和阐释该抗体抑制肿瘤转移的作用及分子调控机制，为肿瘤转移的临床治疗提供新思路，为这一新型胞内抗体进入临床奠定基础。

肿瘤转移是引起癌症患者死亡的首要因素,寻找新的防治肿瘤转移的有效方法及其机制研究，具有重要的科学价值和现实意义。CDK4是细胞进入增殖周期第一个被激活的周期蛋白依赖性蛋白激酶，它的过度表达、活化与多种肿瘤的发生、发展、预后及转移密切相关，是肿瘤防治的一个重要靶点。前期研究发现，申请人课题组首次以CDK4为靶点，自主研制的肿瘤靶向抗CDK4胞内抗体（NLS-AK）能够在体内外有效抑制肿瘤的生长，但该抗体能否有效抑制肿瘤转移及其分子机制尚不清楚。鉴于此，本课题通过肿瘤细胞体外迁移、侵袭实验及动物转移模型研究，明确该抗体体内外抑制肿瘤转移效能，进而结合蛋白质相互作用组学和差异蛋白质组学方法, 分析该抗体对CDK4相互作用组及其介导的相关信号通路的影响，建立该抗体抑制肿瘤转移的分子调控网络，明确和阐释该抗体抑制肿瘤转移的分子调控机制。.研究结果表明，NLS-AK在体外有效抑制肿瘤细胞的迁移和浸润，并降低体内乳腺癌肺转移和原位乳腺癌远端转移能力。利用蛋白质相互作用组学和差异蛋白质组学分析乳腺癌细胞中NLS-AK作用于CDK4后引起的差异蛋白，建立相应的信号调控网络，发现鉴定的差异蛋白主要参与生物合成、转录、翻译、代谢等的调节。进一步验证分析表明，NLS-AK的表达显著上调抑癌因子HINT1的蛋白水平，明显下调促肿瘤因子KHSRP，Gal-1，NPM1，CBX3的蛋白水平。GST pull down及免疫共沉淀实验结果表明，NLS-AK的表达不仅明显下调细胞核内CDK4、NPM1和NF-κB/p65蛋白水平，而且抑制了CDK4激酶的活化，抑制其底物Rb蛋白磷酸化，同时NLS-AK削弱细胞核中NPM1与CDK4、磷酸化Rb蛋白及NF-κB/p65相互作用，下调了Rb 及NF-κB/p65下游有关细胞增殖及迁移调控等相关因子的表达。NLS-AK的表达还抑制体内血管生成和细胞的上皮-间充质转换过程，进而降低乳腺癌细胞的迁移和浸润能力。.抗CDK4胞内抗体抗肿瘤转移的作用效能及分子机制的明确和阐释，为这一新型胞内抗体进入临床奠定理论基础, 为肿瘤转移临床治疗提供新思路，为该抗体肿瘤临床靶向治疗策略提供重要的理论基础和参考依据，同时也为胞内抗体作用机制研究建立技术平台。