高效抗Cyclin D1胞内抗体抑制肿瘤细胞增殖的分子作用机制

Cyclin D1是细胞进入增殖周期合成的第一个周期蛋白，是肿瘤防治的一个重要靶点。申请人研究组曾首次以Cyclin D1为靶点研制了具有抗肿瘤效应的肿瘤靶向高效抗CyclinD1人源胞内单链抗体，该抗体具有较好的潜在临床应用前景。但目前该抗体是如何与抗原相互作用，进而如何影响Cyclin D1的信号传递，抑制肿瘤细胞增殖的分子作用机制尚不清楚。鉴于此，本课题拟利用抗原表位筛选结合计算机模拟来分析抗原抗体的相互作用以及抗体对抗原构象、生物学活性影响的分子基础，同时利用差异蛋白质组学方法分析胞内抗体对Cyclin D1介导的相关信号分子的表达和活化的影响，建立抗Cyclin D1胞内抗体抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的分子调控网络，最后，明确和阐释该抗体的分子作用机制，为这一新型胞内抗体进入临床奠定基础,为该抗体肿瘤临床靶向治疗策略提供参考依据，同时也为胞内抗体作用机制研究建立技术平台。

Cyclin D1是细胞进入增殖周期合成的第一个周期蛋白，是肿瘤防治的一个重要靶点。负责人研究组曾首次以Cyclin D1为靶点研制了具有抗肿瘤效应的肿瘤靶向高效抗CyclinD1人源胞内单链抗体（AD），然而该抗体的抗肿瘤分子机制尚不清楚。鉴于此，本项目利用抗原表位筛选结合计算机模拟来分析抗原抗体的相互作用的分子基础，同时利用差异蛋白质组学方法分析胞内抗体对Cyclin D1介导的相关信号分子的表达和活化的影响，建立抗Cyclin D1胞内抗体抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的分子调控网络，进而明确和阐释该抗体的分子作用机制。 .通过噬菌体肽库筛选、计算机模拟结合突变分析确定了该抗体与抗原作用的表位主要集中在Cyclin D1的 N末端1-120位氨基酸之间，抗体与抗原相互作用的关键氨基酸为N24, K33, K112, M113, K114, E115。定点突变分析发现112位的Lys对于该抗原抗体的相互作用至关重要。利用双向电泳对带有AD或空质粒的MCF-7细胞系进行差异蛋白组分析，发现43个差异蛋白点，质谱鉴定了其中24个蛋白点。这些蛋白参与了代谢、转录与翻译、蛋白质运输等通路。蛋白质组学结合验证分析表明，AD的表达显著抑制促肿瘤因子CBX3，NUDT5和PRDX4等分子的表达，但诱导CRMP2，FUBP2，PCBP1及促凋亡因子GRP78等分子的表达。免疫共沉淀实验、Western blot结果表明，AD能抑制Cyclin D1与CDK4的结合，降低pRB蛋白的磷酸化水平；qPCR结果显示，AD的表达下调CDK1，CDK4，Bcl-2等基因的表达，而上调p21，p27，p53等抑癌基因的表达。同时开展的肿瘤靶向抗CyclinD1胞内抗体对肝癌细胞增殖特性影响的研究，显示出该胞内抗体较好的体内外抑瘤效应。最后，通过抗原抗体相互作用分析及蛋白质组学研究等结果，初步提出AD抑制肿瘤细胞增殖的分子机制：AD可能部分通过结合于Cyclin D1的N末端抑制CDK4的结合，抑制pRB的招募和磷酸化，从而影响下游一系列细胞增殖调控基因的表达，抑制肿瘤细胞的生长和增殖。 .本项研究进一步表明抗Cyclin D1胞内抗体具有较好抑瘤效应，而且初步明确了该抗体的分子作用机制，为这一新型胞内抗体进入临床奠定基础,也为胞内抗体作用机制研究建立了技术平台。