Npas4在产前应激子代大鼠关联性条件化恐惧形成中的调控作用

In previous studies, we found that impairment of spatial learning and memory in rat offspring induced by prenatal stress(PS)were associated with hippocampal damage. Recently, there was a report that PS could impair the formation of contextual fear conditioning(CFC). To species's survival and continuity, the formation of contextual fear conditioning(CFC) is very important that animals can apperceive environments. How does PS impair the formation of CFC in offspring? In this study, we observe the regulation of Npas4 gene in the formation of CFC in offspring by altering the transcription and expression of Npas4 gene of pyramidal neurons in hippocampal CA3 region. Firstly, we examine the formation of CFC on offspring in the model of prenatal-stress rats. Secondly, we obsevrve the density and shapes of apital dentritic spine in pyramidal neurons, record the postsynaptic currents, long-term potentiation and post tetanic potentiation in the hippocampal CA3 region of rat offspring. Thirdly, we measure the transcription and expression of Npas4 gene and associated immediate early genes in hippocampal CA3 region. we also examine the expression and activity of glutamate and γ-GABA receptors in different brain areas. Forthly, by transfecting Npas4 gene into pyramidal neurons in hippocampal CA3 region, we observe the role of Npas4 overexpression in above items. This study try to disclose the mechanism of impairment of associative learning in prenatal-stress offspring and offer new insights to improve the poor ability of associative learning in prenatal-stress offspring.

以往研究发现，产前应激（PS）导致的子代空间学习记忆能力下降与海马损伤有关。最近有报道称PS可以损害关联性条件化恐惧（CFC）的形成。动物通过CFC感知外界，有利于物种的生存和延续。产前应激是如何损伤子代CFC的形成？本研究拟通过改变Npas4基因在海马CA3区锥体细胞的转录和表达，观察Npas4对产前应激子代的关联性条件化恐惧形成的调控作用。首先采用产前束缚应激大鼠模型，结合CFC，观察海马CA3区锥体细胞顶树突棘密度和形态；然后记录海马CA3区的突触后电流、长时程增强和强直后增强；检测海马CA3区Npas4基因的转录和表达，相关的即刻早期基因的转录和表达，以及不同脑区谷氨酸和γ-氨基丁酸受体的表达和活性；并将Npas4基因转入海马CA3区锥体细胞，上调其表达，观察上述指标的改变。本研究将明确产前应激对子代联合型学习损伤的机制，将为临床寻求早期干预提供理论依据和新措施。

最近有报道称在动物的关联性条件化恐惧（CFC）试验中，PS可以损害情境学习的形成。动物通过CFC感知外界，并习得应对外界危险的能力，有利于物种的生存和延续。在脑边缘系统丰富表达的神经元活性依赖的转录因子神经元PAS域蛋白-4 (Npas4)，被认为可以被CFC激活，从而上调一系列即刻早期基因的转录和表达，在CFC的形成中起重要作用。那么，产前应激引起CFC 形成的损伤是否与Npas4相关？本研究通过观察产前应激子代的CFC的形成、海马细胞结构与功能以及相关的蛋白和基因的改变；并通过改变Npas4 基因在海马CA3 区锥体细胞的表达，探索Npas4 对产前应激子代的CFC形成中的调控作用。结果发现，产前束缚应激可以引起1月龄子代大鼠的CFC形成障碍，表现为再次进入恐惧环境后的凝滞时间占总时间百分比明显降低；在CFC训练前，子代大鼠背侧海马Npas4的表达减少，Npas4 mRNA的水平也较对照组降低，免疫组织荧光检测进一步表明，背侧海马Npas4减少主要发生在海马CA3区。同时，背侧海马CA3区锥体细胞顶树突棘密度减少；背侧海马CA3区的LTP的幅值显著降低；背侧海马和边缘前皮质的N-甲基-D-天冬氨酸受体-1（NR1）、N-甲基-D-天冬氨酸受体-2A（NR2A）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑恶唑丙酸（AMPA）受体GluR1和GluR2以及谷氨酸脱羧酶-67（GAD-67）的表达均较对照组显著减少。在CFC训练后的5、30和60分钟，产前应激组子代背侧海马Npas4 mRNA增加的幅度也较对照组低，受Npas4调节的c-Fos等受Npas4调控的基因的mRNA水平增加的幅度也均较对照组低。因此，我们通过慢病毒感染海马CA3区的锥体细胞，上调Npas4的表达，结果发现，海马CA3区注射Npas4病毒可以明显改善产前应激子代大鼠CFC形成的损伤；在CFC训练后的1小时，注射Npas4病毒的产前应激组子代背侧海马Npas4水平达到正常对照组水平；c-Fos和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达水平几乎恢复到正常对照组水平，失去活性的ΔNpas4却没有此作用。.本研究结果揭示产前应激导致的子代大鼠背侧海马CA3区的Npas4减少是其CFC形成损伤的原因，下一步的研究可将上调Npas4作为靶点，开发临床可行的改善产前应激子代情境学习记忆损伤的措施和药物。