沼泽红假单胞菌高产辅酶Q10的机制及新策略

It has been reported that photosynthetic bacteria (PSB) accumulate more Ubiquinone-10 (UQ10) than chemoheterotrophic bacteria . Therefore, PSB were concerned in the study of metabolic engineering for UQ10 production. However, the knowledge of high production mechanism of UQ10 in PSB is limited. In order to study the mechanism for UQ10 high-production in PSB, we proposed two hypotheses. One of the hypotheses is that UQ pool is larger in photophosphorylation system than that in oxidative phosphorylation system. The other one is that compensation effect may exist between "light-harvesting" and "electron transferring" for ATP generation in PSB. In our previous study, the UQ10 content in Rhodopseudomonas palustris (R. palustris) was improved to a high level by deleting shc gene to block hopanoids pathway. Therefore, the recombinant strain R. palustris (Δshc) will be employed as the host to analyze the UQ10 content under different culture conditions to prove the first hypothesis. Moreover, the carotenoids (CRT, a component of light-harvesting apparatus) pathway will be blocked, which may stimulate cells to over-produce UQ10 for more powerful electron transport to keep enough ATP generation for bacterial survival. The contents of cytochrome c and chlorophyll will be analyzed to prove these hypotheses. Given that the quorum sensing controls cell density by signal transduction of autoinducer (AI), the genes of proteins in the signal pathway will be blocked to break the inhibitory effect of quorum sensing on cell density. This study aims at providing novel theories and strategies for building the recombinant strains with high UQ10 production.

研究表明，相较于化能异养菌，光合细菌具有更高的UQ10（电子传递体）起始含量，因而在工程菌构建研究中备受关注。然而，目前对光合细菌高产UQ10的机制认识还十分有限。申请人前期通过敲除沼泽红假单胞菌中的shc基因阻断藿烷合成途径使UQ10含量得到大幅提高，本研究以此为基础进一步提出两种假设：“光合磷酸化作用比氧化磷酸化作用需要更多的电子递体”以及 “光捕获和电子传递模块间存在代偿机制”。拟将前期构建的重组菌R. palustris (Δshc)作为出发菌株，通过研究该菌株中电子传递体含量在不同能量代谢方式下及类胡萝卜素（捕光色素）合成途径阻断前后的变化来验证以上假设。此外，本项目还将通过基因敲除法阻断群体感应信号通路，探索提高光合细菌发酵密度的新策略。本研究旨在为构建UQ10高产菌株以实现工业化生产提供理论与技术支持。

辅酶Q10在医药、保健及化妆品等领域具有重要作用，微生物发酵是为最佳生产方式。该项目以前期研究为基础，从三个方面探索了沼泽红假单胞菌中辅酶Q10的高产机制及新策略。首先，以前期构建的重组菌R. palustris [Δshc]为出发菌株，研究其在不同产能方式下的辅酶Q10含量变化，明确了无氧光照为最佳发酵条件，证明光合磷酸化比比氧化磷酸化需要更多的电子传递体（辅酶Q10）。其次，构建R. palustris [Δshc, ΔcrtB]重组菌阻断类胡萝卜素合成途径使辅酶Q10含量提高到4.7 mg/g（细胞干重），相比于野生菌株提高了1.2倍。且研究发现，在传统方法—限速酶超量表达策略的共同作用下，辅酶Q10含量达到了8.2 mg/g（细胞干重），相比于野生菌株提升了3倍。以上结果证明类胡萝卜素途径阻断与限速酶超量表达具有协同提高辅酶Q10含量的作用，同时也阐明了光捕获与电子传递间的代偿机制。最后，通过敲除了信号分子的感应调节蛋白基因（luxR）与自诱导物合成酶基因（luxI），使菌体干重从出发菌株的1.2 g/L提升到双阻断菌株的1.55 g/L，证明了阻断群体感应系统对发酵密度的影响。该项目完成全部计划内容，具有一定的理论和应用价值，为最终实现辅酶Q10工业化生产提供了理论和技术支持。在本项目的资助下，共发表SCI论文2篇（1区与4区各1篇），正在评审1篇（4区），正在投稿1篇（4区）。