脂肪间充质干细胞旁分泌在损伤声带修复中的作用研究

Irreversible dysphonia caused by irregular deposition and organization of extracellular matrix in the lamina propria after vocal fold injuries is difficult to treat. In our previous studies, we found that adipose-derived mesenchymal stem cells-extracelluar matrix complex can promote the vocal fold regeneration, but we also found that the survival rate of the stem cells was very low and not all of them can differentiate to the target cells after implantation. So the ability of stem cells to promote tissue regeneration was limited. To explore the paracrine mechanism of adipose-derived mesenchymal stem cells and its role in the vocal fold regeneration, we plan to utilize the transwell system to coculture adipose-derived mesenchymal stem cell and fibroblasts (normal vocal fold, acute injuried vocal fold and chronic injuried vocal fold), then detect the proliferation and migration of vocal fold fibroblasts and endogenous stem cells, and measure the changes of cytokines and extracellular matrix. Then we apply the neutralization tests to screen the cytokines which play specific roles in the paracrine mechanism. At last, we transfect the genes of specific cytokines to adipose-derived mesenchymal stem cells, then transplant the transfected cells into the injuried vocal folds to achieve the restoration of structure in the lamina propria to the extreme.

声带损伤后固有层细胞外基质无序沉积、紊乱排列，由此导致不可逆的发音障碍是目前国内外治疗的难点。我们前期研究虽然发现脂肪间充质干细胞及其复合物对损伤声带修复再生有一定作用，但干细胞移植入损伤部位后存活率低，并未全部分化为相应的靶组织细胞，使其作用受到限制。本项目拟重点探讨脂肪间充质干细胞 "旁分泌"调控机制在促进损伤声带修复中的作用：利用Transwell共培养体系对脂肪间充质干细胞和正常、急慢性声带损伤成纤维细胞共培养，通过测定声带成纤维细胞及内源性干细胞增殖及迁移能力，检测细胞外基质分泌、合成变化以及细胞因子表达变化，探索脂肪间充质干细胞及相应靶细胞可能的调控机制；进一步通过中和抗体实验筛选旁分泌相关特异性细胞因子；最后将特异性细胞因子基因转染至脂肪间充质干细胞，植入损伤声带动物模型，增强脂肪间充质干细胞"旁分泌"作用，以最大程度的促进声带固有层的修复重建，为声带损伤的治疗提供依据。

声带损伤后固有层细胞外基质无序沉积、紊乱排列，由此导致不可逆的发音障碍是治疗的难点。我们前期研究发现脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cell，ADSC）及其复合物对损伤声带修复再生有一定作用，但干细胞移植入损伤部位后存活率低，并未全部分化为相应的靶组织细胞。本项目探讨ADSC “旁分泌”调控机制在促进损伤声带修复中的作用。首先在体外利用Transwell 共培养体系研究ADSC的旁分泌机制对声带成纤维细胞（vocal fold fibroblast，VFF）的作用，发现ADSC的旁分泌机制能够促进VFF的增殖，抑制其转化为肌成纤维细胞，抑制I及III型胶原的分泌，促进透明质酸合成酶1及2的分泌，提示ADSC的旁分泌作用在体外具有抑制损伤声带过度纤维化的作用。在旁分泌机制中，肝细胞生长因子（(hepatocyte growth factor, HGF）是重要的调节因子。本研究使用慢病毒介导的基因过表达技术，构建过表达HGF的ADSC，增强ADSC的“旁分泌”作用，并将过表达HGF的ADSC植入受损声带内，发现其与未转染的ADSC相比，ADSC在组织内的存活率显著提高, 靶组织中HGF显著增加，I型胶原分泌较少，透明质酸分泌增加，提示通过放大ADSC的旁分泌作用，能够在体内促进损伤声带组织的修复。此外，在声带损伤后纤维化的调控机制研究中，我们还发现，经TGF-β1刺激后，声带固有层成纤维细胞表型的变化会发生变化，成纤维细胞激活并转化为肌成纤维细胞，细胞的迁移及分泌功能增强，Smad3蛋白磷酸化，使用Smad3磷酸化抑制剂后，I型胶原及纤维连接蛋白表达减少，这提示调控TGF-β1/Smad通路相关蛋白可能具有促进声带损伤修复、减轻纤维化的作用，这为研究声带损伤纤维化的机制及调控因素提供了新的方向。