中枢疑核运动神经元变化及再生在喉返神经损伤修复中的作用

喉返神经损伤发病率持续增长，对神经损伤后修复再生机制的研究始终面临巨大挑战。既往研究主要集中在外周神经轴突本身修复与调控，而近年发现外周神经损伤后，中枢核团相应神经元细胞可能转化为神经干细胞，并增殖分化为新生神经元及其他细胞等，成为促进神经修复的重要途径。中枢疑核作为喉返神经上位中枢，其运动神经元的转化在神经修复中的作用渐受关注。本课题拟通过研究大鼠喉返神经部分及完全损伤后中枢疑核运动神经元细胞的转化特征及神经干细胞的再生修复特点，探索中枢神经系统在修复及调节中作用：应用辣根过氧化物酶逆行轴突追踪定位疑核，通过Notch基因检测疑核自身运动神经元凋亡情况；将激光共聚焦免疫荧光共定位方法与层扫技术结合，三维重建疑核运动神经元细胞及转化的神经干细胞，确定神经干细胞的来源、结构和功能特征；通过体外培养定向诱导确认神经干细胞多向分化潜能，并将神经干细胞移植至损伤部位，探究其对神经修复的促进作用。

喉返神经损伤后，中枢疑核作为其上位中枢，其运动神经元的转化及再生在神经修复中发挥一定作用。喉返神经撕脱伤后，中枢疑核运动神经元细胞数目逐渐减少，但出现大量星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞，并于伤后6小时在同侧中枢疑核出现Nestin阳性的细胞，提示喉返神经撕脱伤后中枢疑核可能出现神经前体细胞参与修复再生。研究神经前体细胞的来源，发现第四脑室及脊髓中央管的神经干细胞在喉返神经撕脱伤后开始向同侧疑核迁移，并进行分化，且在疑核内只分化为星形胶质细胞，说明在喉返神经撕脱伤后，第四脑室及脊髓中央管的内源性神经干细胞试图迁移至疑核进行修复；同时我们还发现，喉返神经撕脱伤后同侧疑核自伤后6小时出现的神经前体细胞与幼稚神经元标记物TuJ1共定位，但不与室管膜区的神经干细胞共定位，考虑疑核出现的神经前体细胞为成熟神经元“返祖”转化而来，并不是由室管膜区的神经干细胞迁移而来的。喉返神经横断伤、钳夹伤后，同侧疑核神经元数目未见明显变化，星形胶质细胞及小胶质细胞数量增多，其变化规律与撕脱伤组相似，但数目较少，未观察到增殖细胞及迁移来的细胞，说明中枢疑核运动神经元的变化再生与可能与喉返神经的损伤方式相关。对可能参与中枢疑核损伤修复的神经元细胞、星形胶质细胞、神经干细胞的迁移、分化能力进行研究，发现喉返神经撕脱伤后7天，只在第四脑室与疑核之间的区域发现多唾液酸神经细胞黏附因子阳性的细胞，且与幼稚神经元标记物TuJ1共定位，提示在喉返神经撕脱伤后，同侧的中枢疑核周围的幼稚神经元细胞通过降低其细胞的黏附性，以调节细胞间的相互作用、便于神经的生长及结构的重塑。在对喉返神经损伤后外周神经系统变化研究中发现，喉返神经横断伤后21天喉返神经的神经纤维被纤维细胞替代，伤后28天偶见粗大的形态基本正常的有髓神经纤维，提示伤后28天是喉返神经横断伤后神经再生的关键时期；喉返神经钳夹伤后1周有髓神经形态可基本正常，但声带运动未恢复，提示喉返神经钳夹伤后神经结构的恢复早于神经功能的恢复。在脂肪间充质干细胞（ADSCs）及体外诱导分化的类雪旺细胞（dADSCs）修复大鼠缺损迷走神经（完全损伤）及钳夹伤喉返神经（不完全损伤）的研究中，我们发现ADSCs及dADSCs植入可促进缺失的迷走神经的修复再生，但声带运动功能未恢复；ADSCs及dADSCs植入可加快钳夹伤后的喉返神经再生及声带运动功能恢复。