壳聚糖-微量元素螯合物在断奶仔猪小肠的吸收利用及对肠道屏障的保护机制研究

This study will be conducted to study the absorption and utilization of chitosan-mineral element chelates (chitosan-Zn, chitosan-Cu) and their effect on intestinal barrier in weanling piglets. Research methods are as follows: The determination of solubility, X-ray diffraction (XRD), atomic force microscope (AFM) and acute toxicity test will be used to evaluate chelates' chemical characteristics and safety. The bioavailabilities of chelates in weanling piglets will be determined by multivariate linear slope ratio method. The gene expression of zinc or copper transporters in intestinal mucosa will be investigated by real-time RT-PCR and their expression in situ in mucosa will be determined by immunohistochemical and confocal microscope. Everted intestinal sac method will be used to investigate absorption characteristics and pattern of chelates in porcine intestine. Real-time RT-PCR method will also be used to evaluate the gene expression of mucosa tight junction protein and Mucin. Intestinal epithelial cell apoptosis and mucous sIgA concentration will be determined by Tunel and ELISA method, respectively. These results will provide basis for chelates' utilization in animal science as a new type of organic mineral elements. The aim of this work is focussed on increasing safety of animal production, saving resource and considerably decreasing environmental pollution caused by utilization of high-dose mineral elements in animal feed.

在前期自行研制壳聚糖-微量元素螯合物(锌、铜)并在断奶仔猪上应用获得明显效果的基础上，本项目拟探讨其在断奶仔猪肠道吸收利用及保护肠道屏障的作用机制。首先通过溶解度、X-射线衍射光谱、原子力显微镜及毒性试验，研究其化学性质和安全性；继而采用多元线性斜率比法，断奶仔猪为试验对象，探讨其相对生物学利用率；采用荧光定量PCR法分别检测小肠锌、铜转运载体基因表达，免疫组化结合激光共聚焦技术分别检测转运载体原位表达；运用仔猪外翻肠囊技术分别探讨螯合物的吸收特点和吸收方式；采用实时荧光定量PCR技术检测肠道上皮细胞紧密连接蛋白、粘蛋白Mucin的基因表达变化，用Tunel法检测小肠上皮细胞凋亡，ELISA法测定肠黏液分泌性免疫球蛋白sIgA含量。为其作为新型有机微量元素明显提高其生物利用和动物生产性能的作用效果提供科学依据，旨在提高畜产品食用安全性、节约资源并大幅度减轻微量元素引起的环境污染。

本项目探究壳聚糖-微量元素锌螯合物(CS-Zn)在断奶仔猪肠道吸收利用以及保护肠道屏障的作用机制。通过溶解度分析、X-射线衍射光谱、原子力显微镜图等获得CS-Zn螯合的最适条件；小鼠经口急性毒性试验表明CS-Zn属实际无毒；与硫酸锌相比，CS-Zn能显著提高血清、肝脏和胰脏锌含量，通过多元线性回归分析得到相对硫酸锌的生物利用率，以血清锌为因变量，得到CS-Zn相对生物利用率为137.5%；以肝脏锌含量为因变量，得到CS-Zn相对生物利用率为110.9%；以胰脏锌含量为因变量，得到CS-Zn相对生物利用率为149.0%；CS-Zn显著提高了肠道锌转运蛋白ZIP4、ZIP5和ZnT1蛋白表达量；外翻肠囊试验表明，CS-Zn 处理组MT mRNA相对表达量高于硫酸锌处理组（P<0.05），而ZIP4表达量低于硫酸锌组（P<0.05）。CS-Zn能明显降低肠道上皮细胞凋亡，提高肠粘液中SIgA含量（P<0.05），而对粘蛋白Mucin基因表达无显著影响；可降低肠黏膜TLR4和 NF-κB表达，进而影响炎症因子释放, 表现为促炎因子含量降低，抑炎因子含量提高，从而缓解炎症反应；可提高小肠黏膜抗氧化酶活性和二糖酶活性，提高小肠绒毛高度、降低隐窝深度。综上所述，壳聚糖锌相比硫酸锌具有更高的生物学效价，并能提高小肠黏膜抗氧化能力和肠道粘膜免疫功能，改善小肠绒毛形态，从而增强仔猪消化吸收功能，提高生长性能。