鳕鱼源螯合肽促矿物质吸收和转运机制及分子机理

Minerals, such as calcium, zinc and iron, exert biological activities in human body and are important for health. Mineral deficiencies have become a serious problem due to low absorption in dietary. Food derived chelating peptides have been shown to possess potential mineral chelating activity. The ability of enhancing mineral absorption of chelating peptides has been studied. In this research, Alaska pollock skin as a aquatic byproduct is selected as raw material to generate chelating peptides. Enzymatic hydrolysis is employed to hydrolyze Alaska pollock skin derived collagen in order to obtain mineral chelating peptides. Consequent chromatography, including immobilized metal affinity chromatography (IMAC), ion exchange chromatography (IEC) and gel permeation chromatography (GPC) is employed for the separation and purification of chelating peptides. The purified peptides are identified by mass spectrometry and are synthesized for further investigation. Synthetic peptides are used for the study of their resistant to gastrointestinal digestion. The absorption and transport mechanism of the chelating peptides on mineral availability is evaluated using Caco-2 and MG-63 cell model. The molecule mechanism is explored in terms of molecular biological technique. This study combines food science, analytic chemistry, cell biology and molecular biology as well as chromatography and mass spectrometry technique. This research will clarify the approach schematic and illustrate the potential possibility of chelating peptides as a new nutritional supplement. This research will also provide important information for chelating peptides as functional ingredient in the management of mineral deficiencies.

矿物质如钙、锌和铁对人体健康发挥着重要作用。因摄入不足导致的矿物质元素缺乏症严重影响人体健康。一些具有矿物质螯合作用的食源蛋白肽具有潜在的促矿物质吸收的功能。本研究主要以水产加工副产物鳕鱼皮为原料，以食源性螯合肽的促矿物质吸收作用为着眼点，通过定向酶解制备技术获得含量丰富的螯合肽，运用亲和层析、离子交换和凝胶色谱分离跟踪螯合肽，通过液质联用技术对螯合肽进行鉴定。运用多肽合成技术，以螯合活性单肽为研究对象，研究其在消化吸收过程中的稳定性。通过Caco-2和MG-63细胞培养手段阐明螯合肽的矿物质吸收和转运机理，结合分子生物学技术阐明螯合肽的分子作用机理。本课题涉及食品科学、分析化学、细胞生物学和分子生物学等学科，结合色谱、质谱等多种技术手段，从螯合肽的纯化、鉴定及其作用机理在整体上阐述螯合肽作为新型矿物质营养补充剂的理论可能性，为开发螯合肽成为新型的功能食品成分提供理论依据。

经过课题组4年来的研究，形成了如下研究结论和成果： .1、本研究创立了一种固定化金属亲和层析对小分子螯合肽的分离方法，建立了一种用于螯合肽的组合使用固定化金属亲和层析、凝胶色谱、反相色谱相结合的分离纯化策略。.2、本研究从鳕鱼皮、鳕鱼骨等原料中分离纯化并鉴定出12条矿物质螯合肽，即钙螯合肽WR、SGSTGH、GPAGPHGPPG、KGDPGLSPGK，锌螯合肽LGER、GPAGPR、AGPAGPR、VGLIGPR和NGPAGPR，铁螯合肽GPAGPHGPPG、SCH，铜螯合肽SAC、GPAGPHGPPG和GPVGPHGPPGKDG。其中GPAGPHGPPG同时具有钙螯合活性、铁螯合活性以及铜螯合活性。为新型钙制剂的制备和研发提供了理论基础。.3、本研究证明钙离子和多肽螯合之后制备的钙肽螯合物可显著增加大鼠对钙离子的吸收与利用，提高钙的表观吸收率以及储留率。抗骨质疏松试验证明CBP-Ca可以有效缓解由去卵巢手术造成的骨质疏松，显著提高血清钙浓度，下调由去卵巢引起的高骨转化率，抑制骨吸收作用，增强去卵巢后骨质疏松大鼠的骨密度，恢复骨小梁结构，进而提高骨骼的机械强度，缓解骨质疏松。.4、本研究通过圆二色光谱、红外光谱等技术研究了金属离子螯合肽与金属离子结合之后结构上的变化，结果证明金属离子螯合肽在与钙、铁、锌等金属离子结合之后结构变的更加紧密，多肽中的的羧基以及氨基均参与了金属螯合反应。.5、本研究以KGDPGLSPGK这条钙螯合活性肽为代表，在光谱分析的基础上，利用质谱手段对其进行分析，结合光谱结果得到了准确的钙肽结合位点：多肽KGDPGLSPGK第3位上的天冬氨酸与末端的赖氨酸中的羧基以及末端赖氨酸侧链上的氨基一起参与了钙肽螯合反应。在鉴定多肽KGDPGLSPGK准确的钙结合位点的基础上，构建了出了其与钙离子结合模式图。为金属离子多肽螯合物的研究提供了理论基础。.6、为深入探究鳕鱼源金属离子螯合肽促金属离子吸收的作用机制与机理，本研究建立了CaCo-2细胞模型来模拟小肠上皮环境，最终CaCo-2细胞试验证明鳕鱼源金属离子螯合肽可显著上调CaT1 mRNA、 PMCA1b mRNA、DMT1 mRNA、FPN1 mRNA、ZnT1 mRNA等基因的表达，进而促进小肠上皮细胞对铁离子、锌离子、钙离子等有益金属离子的吸收与利用。