血循环microRNA-185作为一种新的食管癌诊断生物标志物及其调控食管癌细胞功能的研究

microRNA （miR）is differential expression between tumor and normal tissue, which can secrete into blood. Importantly, miR can be measured in the blood of early cancer patients. Deregulation of RAGE may be a critical step in tissue reorganization during formation of tumor. We first found that high expression of RAGE in esophageal cancer. By Pictar、Miranda、TargetScan, we predicted that miR-185 might target RAGE. The aim of the present study is to investigate circulating miR-185 expression in esophageal cancer of different patho-stage, types, treatments and their relationship with the clinical features. Meanwhile, we will regular follow-up some patients and study the diagnostic value of circulating miR-185 in esophageal cancer. We will transfect miR-185 Agomir, Antagomir and control into esophageal carcinoma cell and measure related index about proliferation, apoptosis, necrosis and invasion. The animal experiments will be performed. The predicted miR-185 binding site in RAGE 3'-untranslated region (UTR) will be validated by dual-luciferase reporter gene assay. We aim to investigate the correlation of miR-185 and RAGE in esophageal carcinoma. The study will provide a novel diagnostic gene and a new ideal of pathogenesis for esophageal carcinoma.

肿瘤组织微小RNA（microRNA，miR）的表达不同于正常组织，其极可能释放入血，且在早期癌症患者血液中已检测到相应miR。细胞表面RAGE基因表达改变是导致肿瘤形成，组织重构的关键。本课题组首次证明食管癌组织中RAGE高表达，运用多个生物软件分析提示miR-185可能作用于RAGE。本项目拟检测不同病程和不同治疗方案的食管癌患者血浆miR-185表达，同时随访部分病例，研究血miR-185作为食管癌潜在生物标志物的诊断价值；将miR-185的Agomir激动剂，Antagomir抑制剂和对照组转染食管癌细胞和裸鼠动物模型，检测与增殖、凋亡、坏死、侵袭相关指标的含量；双荧光素酶报告基因验证miR-185是否作用于RAGE mRNA 3'非翻译区的预测靶位，并研究食管癌miR-185和RAGE表达的相关性。本研究可为探讨食管癌诊断新途径提供理论依据，并为阐明其分子发病机制提供新理念。

细胞表面晚期糖基化终末产物受体（RAGE）表达改变是导致肿瘤形成，组织重构的关键步骤。我们首次证明RAGE 定位在细胞浆和细胞膜。食管癌中RAGE高表达仅与癌浸润深度有关，当侵及肌层及外层后，其表达水平高于局限在黏膜及黏膜下层者。微小RNAs（microRNAs,miRs）是约19~24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，具有高度保守性，能够与靶基因3’非翻译区互补结合，降解目的基因mRNA或抑制其翻译。我们通过在线生物信息学软件预测miR-185调控RAGE表达；进一步，应用双荧光素酶报告基因实验，细胞转染结合RTFQ-PCR、细胞免疫荧光和Western blot法检测RAGE含量变化证明了miR-185与RAGE的负调控关系。miR-185对食管癌细胞关键性生理功能有怎样的影响呢？在细胞水平，我们通过CCK-8法、MTT法、细胞免疫组化检测Ki-67表达、细胞迁移和侵袭实验、流式细胞仪检测等技术，证明miR-185抑制食管癌细胞迁移和侵袭，而对食管癌细胞的增殖和凋亡作用不明显。进一步，通过构建裸鼠皮下成瘤实验和转移模型，证明miR-185通过miR-185/RAGE /phospho-HSP27信号通路与食管癌转移密切相关。这些研究为食管癌分子靶向治疗提供了新的靶点。重要的是，肿瘤细胞内的miRs极可能释放入血作为生物标记物进行疾病检测。我们通过构建检测血miR-185的RTFQ-PCR方法并应用于食管癌患者血液标本检测，发现与健康对照组相比，食管癌患者血浆miR-185相对含量显著下降，血miR-185可能是辅助诊断食管癌的新分子标志物。.RAGE的功能具有组织和细胞特异性，即在不同肿瘤中具有不同甚至完全相反的生物学功能。值得注意的是，与食管癌不同，RAGE在肺癌中低表达；而同一个靶mRNA可能受多个miRs分子的调控。在完成原定研究计划的同时，我们还通过一系列细胞水平实验和临床标本检测发现调控RAGE的另一miR分子——miR-182，其可下调RGAE表达显著影响非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡；同时miR-182释放入血液在NSCLC患者血液中高表达，血miR-182可能是辅助诊断NSCLC新的分子标志物。.总之，本研究为胸部常见恶性肿瘤——食管癌和肺癌的辅助诊断提供新分子，并为两种肿瘤的分子靶向治疗提供新的靶点。