活性维生素D缺乏在骨质疏松发生中的作用及机制研究

To investigate whether 1,25(OH)2D3 deficiency accelerates the development and progression of osteoporosis by increasing oxidative stress and DNA damage induced by the down-regulation of NRF2, Sirt1 and Bmi1, subsequently, activating p16-Rb signaling pathway, stimulating cellular senescence and releases of SASP factors, inhibiting the proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoblastic bone formation and enhancing osteoclastic activation and bone resorption, Wild-type and 1α(OH)ase+/- mice will be administrated with exogenous 1,25(OH)2D3, antioxidant NAC, NRF2 activator oltipraz and BCL-2 family protein inhibitor ABT-263, 1α(OH)ase+/- mice with Sirt1/Bmi1 overexpression in mesenchymal stem cells or with the p16 deletion will be generated, their skeletal phenotypes will be analyzed by histopathology, cellular and molecular biology. Results from this project will be hopefully to elucidate mechanisms of role of active vitamin D defficiency in the development and progression of osteoporosis, which will provide experimental and theoretical basis for the application of active vitamin D and the activators or inhibitors of its targets to prevent and treat osteoporosis.

为了明确1,25(OH)2D3缺乏通过下调Nrf2、Sirt1和Bmi1引起氧化应激和DNA损伤增加，激活p16-Rb通路，促进细胞衰老和SASP因子释放，抑制BM-MSC增殖、分化及成骨细胞骨形成，促进破骨细胞活性和骨吸收，从而加速骨质疏松的发生和发展，我们将给予野生型和1α(OH)ase+/-小鼠分别补充外源性1,25(OH)2D3、抗氧化剂NAC、Nrf2激动剂奥替普拉及给予BCL-2家族蛋白抑制剂ABT-263干预，并建立间充质干细胞特异性过表达Sirt1/Bmi1的1α(OH)ase+/-小鼠, p16和1α(OH)ase双基因突变小鼠模型，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法比较分析上述各组动物的骨骼表型差异。本课题研究结果有望阐明活性维生素D缺乏促进骨质疏松发生发展中的作用机制，为活性维生素D及其下游靶标的激动剂或拮抗剂在骨质疏松防治中的应用提供实验和理论依据。

为了明确活性维生素D缺乏在骨质疏松发生中的作用及机制，我们给予野生型和1α(OH)ase+/-小鼠分别补充外源性1,25(OH)2D3、抗氧化剂NAC、Nrf2激动剂奥替普拉及给予BCL-2家族蛋白抑制剂ABT-263干预，并建立MSC特异性过表达Sirt1/Bmi1的1α(OH)ase-/-小鼠及p16和1α(OH)ase双基因敲除小鼠模型，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法比较分析上述各组动物的骨骼表型差异。结果证明1,25(OH)2D缺乏通过下调Nrf2、Sirt1和Bmi1引起氧化应激和DNA损伤增加，激活p16-Rb通路，促进细胞衰老和SASP，抑制BM-MSC增殖、分化及成骨细胞骨形成，促进破骨细胞骨吸收，从而加速骨质疏松的发生和发展，而外源性1,25(OH)2D3、抗氧化剂NAC、Nrf2激动剂奥替普拉、ABT-263干预、MSC过表达Sirt1/Bmi1或敲除p16基因能够不同程度地矫正1,25(OH)2D缺乏或高龄引起的骨质疏松。机制研究证明1,25(OH)2D3经VDR介导能够直接上调Nrf2的基因转录或通过其启动子的表观遗传调控下调Keap1，以激活Nrf2抗氧化信号，并能够直接转录上调Sirt1和Bmi1的基因表达。Nrf2或Bmi1敲除在体内、外显著阻断1,25(OH)2D3在抑制氧化应激、促进成骨分化和骨形成中的作用。Sirt1通过降低FoxO3a/PGC1α乙酰化水平发挥预防活性维生素D缺乏致骨质疏松和骨关节炎的作用。1,25(OH)2D3通过VDR介导转录上调Ezh2酶，使H3K27ma3在p16/p19转录起始位点上游、周围及下游内含子中富集而抑制p16/p19转录，促进BM-MSC的增殖和成骨分化，抑制其衰老。我们的研究不仅揭示了活性维生素D抗骨质疏松的新机制，而且为活性维生素D及其下游靶标的激动剂或拮抗剂在骨质疏松防治中的应用提供实验和理论依据。此外，我们的研究发现在小鼠肾、肠、骨组织中1α(OH)ase蛋白表达水平随着年龄的增加而下调，因此说明老年人群补充维生素D不能预防衰老相关疾病的发生和发展主要与1α(OH)ase表达水平降低而不能合成足量活性维生素D有关。我们还发现活性维生素D通过维持钙磷平衡和氧化还原平衡发挥抗衰老和抗骨质疏松的作用，为开发具有活性维生素D作用，但没有活性维生素D副作用的延缓衰老和防治骨质疏松