Bmi1在维持雄性生殖功能中的作用及机制研究

To determine whether Bmi1 deficiency resulted in male infertility by activating p16-Rb and p19-p53 signalling pathway, increasing oxidative stress and DNA damage, subsequently inducing defects in spermatogonial stem cell self renewal and spermatogenesis, we will generate Bmi1 null mice with the overexpression of LacZ gene (LacZTgBmi1-/- mice), transplant spermatogonia derived from LacZ transgenic mice or LacZTgBmi1-/- mice to the testes of busulfan-treated mice to observe the effect of Bmi1 deficiency on spermatogonial stem cell self renewal capacity; Bmi1-/- mice will be fed fed a dietary antioxidant NAC (N-acetyl-cysteine) or PQQ (pyrroloquinoline quinone) and double Bmi1 and p16 or p53 or Chk2 mutant mouse models will be generated, reproductive phenotypes will be analyzed and compared each other using histopathological, cellular and molecular techniches，including alterations of life span, body weight, testis size and weight, tissue structures of testes and epididymis, sperm number and vitality, proliferation and apoptosis of spermatogenic cells, oxidative stress and DNA damage in testis tissue and the expression of cell cycle and apoptosis regulating proteins. This study will elucidate mechanisms of role of Bmi1 in maintaining male reproductive function, thus will provide novel target and experimental basis for the clinic treatment of male infertility.

为了明确Bmi1缺失是否通过激活p16-pRb及p19-p53信号通路，增加氧化应激和DNA损伤，引起精原干细胞自我更新和精子发生障碍，从而导致雄性小鼠不育，我们将建立LacZ转基因的Bmi1基因敲除(LacZTgBmi1-/-)小鼠，通过精原细胞移植，观察Bmi1缺失对精原干细胞自我更新能力的影响；将给予雄性Bmi1-/-小鼠补充抗氧化剂NAC(N乙酰半胱氨酸)或PQQ(吡咯喹啉醌)，并建立Bmi1和p16或p53或Chk2双基因敲除小鼠模型，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法比较分析上述各组动物的生殖表型差异，包括生存期、体重、睾丸大小和重量、睾丸和附睾组织结构、精子数量和活力、生精细胞的增殖和凋亡、睾丸组织的氧化应激、DNA损伤、细胞周期和凋亡调控相关蛋白等相关指标的变化，阐明Bmi1在维持雄性生殖系统功能中的作用机制，为临床治疗男性不育提供新靶标和实验依据。

B细胞淋巴瘤滤过性病毒插入位点1(B cell-specific MLV integration site-1，Bmi1)基因属于Polycomb基因家族成员，与多种干细胞的自我更新相关，其缺失将会引起小鼠生长阻滞及成熟前衰老。先前研究发现，Bmi1表达于精原干细胞上，而敲低精原细胞中Bmi1能够显著抑其增殖。然而，Bmi1缺失是否会在体内影响精子发生尚不清楚。在本研究中，我们首先利用Bmi1敲除(Bmi1-/-)小鼠，观察Bmi1缺失对精子发生的影响。随后，我们探究Bmi1下游信号通路包括p16、p19-p53及氧化应激和DNA损伤信号通路在Bmi1-/-小鼠睾丸中的活化情况。最后，我们通过建立Bmi1和p16或p53双基因敲除小鼠及给予Bmi1-/-雄鼠抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸(NAC)或吡咯喹啉醌(PQQ)补充，观察分别通过阻断 p16、p19-p53信号通路及氧化应激和DNA损伤信号通路能否纠正Bmi1缺失引起的精子发生障碍，并探究各条信号通路之间存在的相互作用。我们研究结果发现：相较于WT小鼠， Bmi1-/-雄鼠完全不育、睾丸明显减小、重量明显降低、生精结构紊乱，总体呈现出生精障碍表型。而这主要与Bmi1-/-雄鼠睾酮合成不足、生精细胞增殖降低和凋亡增加及精子成熟障碍相关。对于分子机制研究发现，Bmi1下游信号通路包括p16、p19-p53及氧化应激和DNA损伤信号通路在Bmi1-/-小鼠睾丸中均处于活化状态，而通过敲除p16或p53基因或给予抗氧化剂补充均能部分纠正Bmi1缺失小鼠的精子发生障碍，其中抗氧化剂的纠正效果最佳。对于3条信号通路之间相互作用的研究表明，p53基因敲除或p16基因敲除在纠正Bmi1缺失引起的精子发生障碍中，部分分别被p16信号通路或p19-p53信号通路代偿性激活所降低；而抗氧化剂补充不仅能够通过抑制氧化应激，发挥纠正Bmi1缺失引起精子发生障碍的直接作用，而且能够通过抑制p16及p19-p53信号通路，发挥纠正Bmi1缺失引起精子发生障碍的间接作用。本研究结果不仅揭示了Bmi1缺失引起雄性不育的分子机制，而且将为临床治疗男性不育提供了新的靶标和实验依据。