甲状旁腺素相关肽核定位序列和C末端在抗衰老中的作用机制研究

为了明确甲状旁腺素相关肽(PTHrP)核定位序列(NLS)和C-末端是否经Bmi-1介导抑制肿瘤抑制因子，如p16、p27等，刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡，发挥抗衰老作用，拟利用p27基因敲除小鼠（表现为多器官肥大），分别与公认的Bmi-1基因敲除小鼠成熟前衰老模型和我们新建立的PTHrP NLS和C-末端缺失(PTHrP KI)小鼠成熟前衰老模型建立双基因突变模型，从组织、细胞和分子水平比较分析它们与单基因突变小鼠的表型差异；拟利用基因重组方法制备小鼠PTHrP87-139，干预PTHrP KI小鼠，观察PTHrP87-139能否纠正PTHrP KI小鼠衰老表型, 以明确PTHrP87-139是否具有抗衰老作用。本研究不仅有助于阐明PTHrP NLS和C-末端在抗衰老中的作用机制, 为将PTHrP NLS和C-末端开发成抗衰老药物提供实验和理论依据，而且有望发现抗衰老的新靶标。

为了明确甲状旁腺素相关肽(PTHrP)核定位序列(NLS)和C-末端在抗衰老中的作用，利用基因工程方法，在小鼠PTHrP第84位氨基酸序列后插入终止密码TGA, 建立只表达PTHrP1-84, 而缺乏PTHrP NLS和C-末端的PTHrP “knock-in”(PTHrP KI)小鼠模型。PTHrP KI小鼠表现为严重生长阻滞，成熟前衰老，多器官细胞增殖降低和凋亡增加，Bmi1表达下调及核转位减少。Bmi1-/-小鼠也表现为生长阻滞和成熟前衰老表型。通过对Bmi1-/-小鼠的骨骼表型分析发现Bmi1缺失引起软骨细胞增殖降低、凋亡增加而致骨骼生长阻滞；同时引起骨髓间充质干细胞(BM-MSC)自我更新及向成骨分化能力降低，向脂肪细胞形成能力增加，而致成熟前骨质疏松。基因芯片检测发现PTHrP KI小鼠p27基因表达水平上调8.3倍。在PTHrP KI小鼠敲除p27基因使PTHrP KI小鼠生存期延长、体重增加、骨骼生长改善，骨形成明显增加；Bmi1蛋白表达水平上调，而p16和p53蛋白表达水平明显下调。虽然p27在Bmi1-/-小鼠骨组织中表达明显上调，但在Bmi1-/-小鼠敲除p27基因未延长Bmi1-/-小鼠的生存期，也未矫正Bmi1-/-小鼠的生长阻滞及成熟前骨质疏松表型。基因芯片分析发现p27-/-小鼠骨组织Shh信号通路分子表达水平明显上调。Shh-N明显促进野生型小鼠BM-MSC增殖，但未促进Bmi1缺失小鼠BM-MSC增殖, 而Shh受体拮抗剂明显抑制p27-/-来源BM-MSC的增殖。说明敲除p27基因激活Shh通路被Bmi1缺失所阻断。利用基因重组方法成功制备得到小鼠PTHrP87-139，证明基因重组的PTHrP87-139或合成的带FITC标记的PTHrP87-139处理BM-MSCs, 能够进入细胞核，刺激其增殖，抑制其凋亡，上调Runx2和Bmi1表达水平，下调p16、p21和p27表达水平。外源性PTHrP 87-139使PTHrP KI小鼠体重增加、寿命延长、细胞增殖明显增加、衰老细胞明显减少、骨骼生长和成骨细胞骨形成明显增加、Bmi1基因和蛋白水平表达上调，而p16、p21、p27基因和蛋白表达水平明显下调。本研究结果表明PTHrP NLS能够通过胞内分泌的方式上调Bmi1,同时通过抑制p27激活Shh信号通路，进一步激活Bmi1及其下