石杉科药用植物内生放线菌多样性和分离、分类研究

石杉碱甲作为一种低毒、可逆性、高效、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，已有效应用于阿尔茨海默病(早老性痴呆)和重症肌无力的治疗。目前，临床应用的石杉碱甲仅能从石杉科一些药用植物（主要是蛇足石杉）中获得，因而导致了人们对蛇足石杉等药用植物无节制地采收。放线菌素来被称为产生生理活性物质的 "天才菌"，药用植物内生放线菌更是产生高效、新颖、低毒活性物质的药物资源。本项目拟以石杉科4种药用植物为材料，主要开展以下两方面的工作：应用宏基因组分子生态学研究技术和纯培养方法相结合，探索石杉科药用植物内生放线菌的多样性；通过选择性分离和多相分类研究，结合新药模型筛选，搜索具有良好遗传背景的药用放线菌新资源。以期发现具有合成石杉碱甲以及具有产生其它新颖结构先导化合物潜能的放线菌，为实现"植物药物的微生物生产"奠定实验基础，促进新药生产的低碳型经济的发展。

本项目应用宏基因组分子生态学研究技术和纯培养方法相结合，探测了石杉科药用植物内生放线菌的多样性；通过选择性分离和多相分类研究，结合新药模型筛选，搜索到一批具有良好遗传背景的药用放线菌新资源。.通过宏基因组学的研究方法，探测到药用植物蛇足石杉内生菌群落中包含有放线菌类群38个属，其中只有14个属是用纯培养的方法也分离纯化得到的，另外24个属尚未得到纯培养；纯培养方法中得到的放线菌纯培养物分属于放线菌的33个属，其中的16个属是宏基因组测序方法也检测到的，另外的17个属在宏基因组测序中没能检测到。两种检测方法相互补充，初步揭示了蛇足石杉内生放线菌物种组成的多样性。.应用纯培养的方法从蛇足石杉等石杉科药用植物组织中分离获得356株内生菌，菌株16S rRNA基因信息显示，其中的16株菌的16S rRNA基因序列与其近缘菌的最高相似性<98.65%，代表了12个潜在的新分类单元（新种或新属）。其中9株菌的分类学工作已经完成，已经或即将发表于SCI源期刊Int. J. Syst. Evol. Microbiol.上。.使用耻垢分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、水稻白叶枯病菌PXO99A和临床分离的多重耐药菌粪肠球菌HH22等作为检定菌的筛选模型与抑制SS04 生长的降血脂药物筛选方法以及基于假型病毒系统的抗HIV-1药物筛选模型对356株内生菌的发酵液样品进行了抗细菌、抗耐药菌、降血脂及抗HIV-1等活性的初步检测，结果显示，74株菌在一个或多个筛选模型中显示出活性，初筛总阳性率为23.0%。.本研究对我国蛇足石杉等珍稀药用植物内生菌的多样性进行了初步评价，获得了植物内生放线菌群落结构及生理活性多样性的重要信息，为深入了解菌株与宿主植物、内生菌群落之间的相互作用，以及进一步研究内生菌代谢途径和活性成分，提供了优秀的菌种资源；也为内生菌资源的保护、开发利用及重要功能基因的发掘提供重要的基础材料。