部分藏药植物内生放线菌的分离和多相分类研究

本项目围绕药用植物内生菌这一研究热点，聚焦于几种藏药植物内生放线菌的分离和系统分类学研究。应用Real-Time PCR分子生态技术探测藏药植物内生放线菌组成，据此，设计选择性分离方法分离内生放线菌。通过脂肪酸定量分析方法发现新菌种，同时运用新药筛选技术平台体系建立的PCR快速筛选模型筛选出具有药用潜力的菌种；应用现代放线菌多相分类体系，实现新菌种和有药用潜力的菌种的多相分类研究，丰富放线菌资源，为微生物系统学研究提供宝贵的实验材料和有用信息。结合多相分类研究结果，更新完善放线菌脂肪酸数据库，创建放线菌快速识别体系，丰富放线菌分类学。

本项研究应用纯培养和免培养相结合的方法探索了药用植物内生放线菌的多样性；发现了一批具有学术研究价值和应用研究潜力的药用微生物资源；系统总结了植物内生放线菌的生物学特性。. 通过比较，确定了植物表面消毒程序（草本和木本植物处理时间略有区别）：Tween 20 (0.01％) 处理30~50s→次氯酸钠处理 (有效氯含量为4.5％～5％) 4~5 min→无菌水冲洗3次→酒精(75％)处理5~6 min→无菌水冲洗3~5次→置于无菌（铺有消毒纱布或滤纸）培养皿中干燥。应用免培养的分子生态学手段探测了藏药植物内生环境放线菌的多样性。建立了内生放线菌有效的分离培养方案：以纤维素二糖为主要碳源的分离培养基和以酵母膏为主要营养来源、添加复合维生素和丙酮酸钠的寡营养培养基为传代培养基；分离、纯化、培养得到藏药植物内生放线菌1225株，分属于34个科，55个属，从中发现了76株菌可能代表了40个种水平以上的新分类单元，其中8个新分类单元的多相分类研究工作已经完成。通过生理生化实验和系统发育分析，探索了部分内生放线菌的生物学特性和生态分布特点：系统进化地位相近的菌株在生理学特征更趋于一致；药用植物内生放线菌在唯一碳源利用、发酵碳源产酸及酶学活性等生理生化特性方面没有表现出和宿主植物的直接相关性，而是呈现出和宿主植物的地理分布有一定的相关性。通过6种新药筛选模型的筛选，初步发现了5株具有继续做新药研究潜力的候选菌种。进一步完善了放线菌分类学中的脂肪酸和甲基萘醌数据库建设。