非可控性炎症条件下正常胃上皮细胞向肠上皮化生恶性转化的精确动态转录因子调控网络研究

The transformation from normal gastric epithelia cells to intestinal metaplasia is the first irreversible malignant event during the development of intestinal-type gastric cancer. This transformation is closely associated with chronic inflammation induced by Helicobacter pylori infection. However, the underlying mechanisms associated with this first step in the eventual transformation to malignancy are unclear. This project uses a new method to construct highly detailed, dynamic transcription factor regulatory networks to explain malignant transformation. Combining laser microdissection, deepCAGE, and second-generation sequencing technologies, normal gastric epithelia cells and intestinal metaplasia at different stages of malignancy in the same intestinal-type gastric cancer will be isolated and the 20 bases at the 5’ end of all mRNA in these cells will be sequenced. Subsequent data mining will identify all transcription start sites and the promoter usage at each with single base resolution. Together with the known transcription factor binding sites and the location information from the position weight matrix, the activity and interrelations of the transcription factors will then be determined across the entire genome. Finally, a detailed dynamic transcription factor regulatory network with high quality will be constructed. Based on this network, the key factors for cell malignant transformation and important network nodes will be identified. In total, these results will reveal strategies for early prevention and treatment of intestinal-type gastric cancer, as well as provide basic information that will be applicable to other inflammation-tumor transformations. The established technology in this project will also clearly be of general use for the identification of transcription factor regulatory networks of other types of malignant transformation as well.

在幽门螺杆菌感染引起的非可控性炎症条件下，胃正常上皮细胞向肠上皮化生转化是肠型胃癌发生的第一次不可逆的细胞恶性转化，但是细胞恶性转化的机制尚不清楚。本项目利用精细动态转录因子调控网络构建的新方法，结合激光显微切割分选技术，deepCAGE技术和第二代高通量测序技术，对同一肠型胃癌组织中正常胃上皮细胞和不同恶性程度的肠上皮化生，对mRNA 5’末端的20个碱基进行高通量测序，获得单碱基分辨的转录起始位点信息和启动子使用情况，结合已知的转录因子位点和位置权重矩阵，在全基因组的尺度分析转录因子在细胞转化过程中的活性和相关性，构建高质量的精细动态转录因子调控网络，寻找肠上皮化生发生的关键因素和重要的网络节点，将为肠型胃癌的早期防治提供策略，同时为其它类型的炎症－肿瘤转化机制研究提供线索，所建立的技术显然也适用于其他类型细胞恶性转化的转录因子调控网络研究。

肠上皮化生是正常胃上皮细胞在非可控性炎症条件下的肠型胃癌早期病变。目前，首先，关于肠上皮化生是否是真正的癌前阶段尚存在争议。其次，如果肠上皮化生具有向胃癌转化的潜质，这种细胞恶性转化的机制是什么？本项目的完成在这两个方面都部分回答了上述的关键科学问题。. 首先，我们建立了一套少量细胞，甚至在单细胞尺度研究微卫星变化的方法，通过对胃镜中的肠上皮化生进行精细空间分辨的分析，发现在肠上皮化生单腺体的内部已经出现高频的微卫星变化，而且在单腺体内出现多个克隆，不同的微卫星变化可以在逐步积累。另外，出现的微卫星变化可以通过腺体分裂的方式进行扩散。相似的结果也在肠型胃癌边界的肠上皮化生中出现。通过外显子测序，我们发现肠上皮化生阶段不仅出现微卫星不稳定，而且出现大量的单碱基多态性和拷贝数变化，说明在肠上皮化生阶段已经存在多种导致基因组不稳定的机制。在这些基因组不稳定机制的情况下，基因组允许高频变动，如果这些变动发生在癌相关的关键基因上，将引起细胞的进一步恶性转化。我们的研究也说明了肠上皮化生具有向胃癌转化的潜质，在临床上应该给予高度的重视。.其次，为了研究细胞恶性转化的关键机制，我们从转录起始位点变化的角度进行了研究。首先，我们建立了全基因组单碱基分辨的转录起始位点分析技术——CAGE技术。我们利用了该技术进行了S. pombe的全基因组核心启动子的分析，一方面验证了方法的可行性，更重要的是，为构建动态调控网络的复杂基因调控摸索了计算方法。其次，我们利用所建立的CAGE技术和计算方法，在细胞系水平对永生化的胃细胞系和肠型胃癌细胞系进行了全基因组尺度的转录起始位点测量，通过比较不同细胞恶性转化的CAGE数据，我们得到了细胞恶性转化过程中一些关键基因表达的启动子的不同使用，表达活性的不同，以及在细胞恶性转化过程中可能参与的转录因子。我们的研究结果发现有一些基因，这些基因的转录起始位点的使用不同，导致了翻译产物的长度发生变化，从而影响该产物在pathway中的功能。我们的研究说明了细胞的恶性转化还可能通过对于转录起始位点的不同利用而实现。.通过本项目的研究，我们首先从基因组的角度分析，确定了肠上皮化生作为癌前阶段的重要性。其次，从转录调控的角度指出，对于不同转录起始位点的利用可能是细胞恶性转化的新途径。本项目的完成进一步加深了对于理解肠型胃癌的发展，为肠型胃癌的早期防治提出了策略。