利用斑马鱼模型研究TRIM45基因在血祖细胞形成与分化中的作用

We have cloned a potential hematopoiesis related gene named TRIM45, and the protein product of this gene belongs to tripartite motif(TRIM) family. Some of TRIM family members might play an important role in regulating hematopoiesis in animal models. We have got some evidence supporting TRIM45 might play a role in regulating the formation and differentiation of hemangioblast during the early stage of embryo development. Using zebrafish as a animal model, this studies will focus on the the the biology function of TRIM45 on hematopoiesis and the potential signal pathway. 1）Using the method of in situ hybridization to study the spatiotemporal model of TRIM45. 2）Combining of Morpholinos oligos to knockdown and mRNA rescue to study the relationship between TRIM45 and differentiation of hemangioblast；3）Constraction of knockout and transgene zebrafish model to study the potential role the TRIM45 in regulating the formation and differentiation of hemangioblast；4) Combining the study on cell lines to understand the molecular signal pathway during the formation and differentiation of hemangioblast. Identification of key regulators in hematopoiesis might be of significance in clarify the molecular mechanisms underlying each process, build up the regulation signal pathway, and provide appropriate candidates for clinical treatments.

申请人克隆了一个造血相关侯选基因TRIM45，其编码蛋白属于具有三元模体的TRIM家族，此类蛋白在器官早期造血过程中发挥重要的作用。前期研究结果提示TRIM45在胚胎早期发育阶段可能与血祖细胞形成和分化的调控相关。本项目拟采用斑马鱼为模型研究该基因在血液发育的生物学功能、探讨其调控的信号途径：1）利用原位杂交等技术研究TRIM45基因在胚胎发育阶段的时空表达模式；2）利用Morpholinos反义寡核酸阻断翻译和mRNA拯救技术鉴定TRIM45与血祖细胞分化的关系；3）建立斑马鱼基因敲除和转基因动物模型，鉴定TRIM45在血祖细胞形成和分化中的功能；4)结合细胞模型探讨TRIM45在血祖细胞形成和分化中的分子调控信号途径。通过对造血过程中关键调节因子的研究有利于揭示造血作用的分子机制，完善调控信号途径，可能为相关疾病的治疗提供理论基础。

TRIM45基因属于具有三元模体的 TRIM 家族，此类基因在器官早期造血过程中发挥重要的作用。本项目采用斑马鱼为模型研究该基因在血液发育的生物学功能、探讨其调控的信号途径. 首先原位杂交和RT-PCR结果表明：TRIM45在斑马鱼中广泛表达且高表达于血液血管处；Western-blot结果显示TRIM45蛋白在斑马鱼胚胎发育的各时期均表达，在血液中的表达较强烈。.其次利用斑马鱼TRIM45基因特异性的morpholino敲减，发现斑马鱼血管与血液发育异常；进一步运用 TALEN敲除技术得到3个斑马鱼TRIM45基因的敲除品系，敲除系F2代致死分析表明TRIM45基因敲除纯合子突变致死，敲除系的表型分析发现斑马鱼节间血管、尾部动脉和静脉发育受到抑制以及血细胞数目明显减少，结果表明TRIM45在斑马鱼血液与血管形成中起着十分重要的作用。.胚胎原位杂交检测血液标志基因、原始红细胞祖细胞标记性基因、原始髓系细胞祖细胞标记基因均在TRIM45敲除纯合子中表达显著下调，血红蛋白表达也减少，表明TRIM45是直接调控原始的血细胞发育的；淋巴祖细胞标记基因在斑马鱼TRIM45敲除纯合子中几乎没有表达，髓系细胞分化形成的巨噬细胞和中性粒细胞的数目都受到了影响。造血干细胞标记基因的原位杂交以及在TG（cmyb:egfp, kdrl:mCherry）双转基因斑马鱼中敲除TRIM45表达分析发现，TRIM45敲除纯合子中起源于背部主动脉中的内皮细胞没有正常形成造血干细胞，说明TRIM45是斑马鱼次级造血所必需的。TG（flila:egfp）与TG（kdrl:mCherry）转基因斑马鱼品系，荧光表达直观清楚地显示敲除TRIM45导致斑马鱼节间血管、尾部主动脉和静脉的形成受到明显抑制。TRIM45基因敲除纯合子中内皮细胞标记基因表达均显著减少。这些结果说明：TRIM45基因在斑马鱼血管的形成中起着重要的作用。血祖细胞标记基因原位杂交发现TRIM45基因是通过影响血祖细胞的形成，进而影响血细胞和血管内皮细胞的形成。.上述研究结果表明，斑马鱼TRIM45基因是控制血祖细胞形成与分化的必需调控因子，它参与调控斑马鱼造血系统与血管系统的发育，阐明该基因的分子调控机制，将有助于完善脊椎动物血液与血管发育过程的分子信号网络，可能为今后临床治疗由血祖细胞发育引起的疾病提供新的治疗靶位点。