利用模式生物斑马鱼研究FBL5基因在心脏发育中的功能

申请人克隆了一个人类心脏发育侯选基因FBL5，其编码蛋白属于F-box 蛋白。此类蛋白在细胞时相转换、信号转导、发育等各种生理过程中发挥重要的作用。前期原位杂交研究结果表明FBL5斑马鱼同源基因在胚胎早期发育阶段呈现出典型的心脏发育时空表达模式，提示该基因可能与心脏发育有关，但国际上尚无有关该基因的研究报道。本项目拟采用斑马鱼为模型，结合细胞模型研究该基因的生物学功能,深入探讨其分子调控机理：1）利用原位杂交等技术研究FBL5基因在胚胎发育阶段的时空表达模式；2）利用Morpholinos反义寡核酸阻断翻译和mRNA拯救技术，鉴定FBL5与心脏发育的关系；3）建立斑马鱼基因敲除和转基因实验模型，鉴定FBL5在心脏发育中的功能；4)结合细胞模型探讨其在脊椎动物心脏细胞中的分子调控途径。该项研究将为揭示FBL5基因在心脏发育中的作用奠定基础。

斑马鱼FBL5基因所编码蛋白属于F-box 蛋白，此类蛋白在细胞时相转换、信号转导、发育等各种生理过程中发挥重要的作用，但国际上尚无有关该基因的研究报道。本项目采用斑马鱼为模型，结合细胞模型研究该基因的生物学功能, 深入探讨其分子调控机理。首先利用原位杂交等技术研究了FBL5基因在胚胎发育阶段的时空表达模式，原位杂交研究结果表明FBL5在斑马鱼胚胎早期发育阶段呈现出典型的心脏发育时空表达模式，提示该基因可能与心脏发育有关。其次利用Morpholinos反义寡核酸阻断翻译和mRNA拯救技术，鉴定了FBL5与心脏发育的关系。FBL5 Morpholino注射后斑马鱼胚胎的心脏为畸形，心脏发育环化不完全，呈现线性化心脏。然后结合细胞模型探讨其在脊椎动物心脏细胞中的分子调控途径。本研究重点研究了FBL5基因导致斑马鱼心脏突变表型发生的可能机制。本实验室通过酵母双杂交发现调控心脏发育的Foxp4可能与FBL5发生相互作用，进一步通过CO-IP实验进行分析证明Foxp4可能与FBL5存在相互作用。FBL5基因作为F-box蛋白家族中的一员，有可能参与了泛素-蛋白酶体途径，免疫共沉淀实验分析证明FBL5与Skp1存在相互作用，这说明FBL5影响斑马鱼胚胎心脏发育有可能是通过参与泛素-蛋白酶体途径，影响了细胞内某些蛋白的表达水平来影响心脏表型的发生。荧光素酶报告系统分析实验发现，Nkx2.5的增强子活性会随着细胞中FBL5的表达水平的增强而增强；蛋白水平Nkx2.5的表达量也会随着FBL5的表达增强而增多，说明FBL5能够参与调控心脏发育的关键靶基因Nkx2.5的表达来影响心脏表型的发生。本研究揭示了FBL5基因可能通过Foxp4基因、泛素-蛋白酶体途径及心脏发育的关键靶基因Nkx2.5来调控斑马鱼心脏发育的可能的分子机制，为深入研究FBL5基因调控心脏发育导致斑马鱼心脏表型发生奠定了基础。斑马鱼基因敲除和转基因实验模型的研究还在进行中，该项研究可能为揭示FBL5基因在心脏发育中的作用奠定基础。