模拟生理环境中朊蛋白错误折叠与聚集的机制

传染性海绵体脑病(TSE)是一种慢性并可在多种哺乳动物之间传播的致死性神经退行性疾病。兔是少数几种对TSE感染因子具有抗性的哺乳动物之一。细胞型朊蛋白错误折叠为致病型朊蛋白发生在拥挤的细胞外膜环境中，而致病型朊蛋白是引起TSE的关键感染因子。本项目以人朊蛋白及其病理突变体和兔朊蛋白为研究对象，利用多糖拥挤试剂结合磷脂模拟拥挤的细胞外膜生理环境，运用生物物理学和细胞生物学的研究手段，研究模拟生理环境中两种朊蛋白错误折叠与聚集的动力学和二级结构变化规律，观察其形成淀粉样纤维程度及形态的差别，检测人朊蛋白寡聚体、原纤维和成熟纤维的蛋白酶K抗性和细胞毒性，并与兔朊蛋白进行比较，探讨细胞外膜生理环境在人/兔朊蛋白错误折叠中的促进/抑制作用，阐明大分子拥挤和磷脂-靶分子相互作用协同影响朊蛋白错误折叠的分子机制，从分子水平上解释兔为何对TSE感染因子具有抗性，为TSE的治疗和最终攻克提供有价值的信息。

传染性海绵体脑病(又称prion疾病)是一种慢性并可在多种哺乳动物之间传播的致死性神经退行性疾病。兔是少数几种对prion疾病具有抵抗性的哺乳动物之一。细胞型朊蛋白错误折叠为致病型朊蛋白发生在拥挤的细胞外膜环境中，而致病型朊蛋白是引起prion疾病的关键感染因子。我们以重组兔朊蛋白为研究对象，并以致病蛋白质人朊蛋白及其病理突变体和牛朊蛋白为对照，利用多糖拥挤试剂模拟拥挤的细胞外膜生理环境，观察和比较了模拟生理环境中这些蛋白质错误折叠的动力学、程度和形态的差异。研究结果表明，生理拥挤环境强烈抑制了兔朊蛋白的错误折叠，相反却显著促进了人朊蛋白或牛朊蛋白的纤维化聚集。蛋白酶K酶解抗性实验则表明，人朊蛋白或牛朊蛋白淀粉样纤维均含有抗蛋白酶K降解的约16 kDa的抗性核心片段，而兔朊蛋白淀粉样纤维则不具有这种抗性核心片段。由于实现有效感染需要感染型朊病毒的积累速率远大于其被细胞内质量控制系统清除的速率，同时抗性核心对于朊病毒的增殖具有重要的加速作用，因此生理拥挤环境的强烈抑制作用和蛋白酶抗性核心的缺乏驱使兔朊蛋白淀粉样纤维在生理环境中很容易被蛋白质质量控制体系所清除，导致兔对prion疾病具有抵抗性。实验结果还表明，一方面，生理拥挤环境显著加速了人朊蛋白及其病理突变体E196K和D178N、人SOD1病理突变体A4V和人Ataxin-3淀粉样纤维形成的成核过程，也强烈促进了被糖原合成酶激酶-3β过磷酸化修饰的人Tau蛋白片段Tau244-441纤维化聚集的成核过程，在神经退行性疾病的病理学进程中发挥着重要的促进作用；另一方面，生理拥挤环境促进了人朊蛋白纤维的片段化，和感染型朊病毒相似，片段化的人朊蛋白聚集体构象不稳定，对蛋白酶K具有高抗性，并能强烈诱导细胞型人朊蛋白生成淀粉样纤维，这可能对于朊病毒感染及复制有着重要影响。相反地，大分子拥挤通过稳定兔朊蛋白单体和卵清溶菌酶单体强烈抑制了这两种蛋白质的错误折叠。我们推断，相比于稀溶液条件，与神经退行性疾病相关的蛋白质在生理拥挤环境中更容易长成纤维；相反，一些非致病蛋白质在生理拥挤环境中则不太可能错误折叠形成纤维。因此生理拥挤环境可能是非致病蛋白质错误折叠的天生防御机制，在蛋白质质量控制体系中发挥重要作用。上述研究增加了我们对神经退行性疾病分子机制的了解，而且有益于阐释生理拥挤环境中蛋白质是如何错误折叠和怎样避免错误折叠的。