人Tau蛋白纤维结构传递的机制研究

Amyloid fibrils which result from protein misfolding can lead to numerous neurodegenerative diseases, including Alzheimer disease of which pathological hallmark is the neurofibrillary tangles caused by abnormal aggregation of microtubule-associated protein Tau in cells. Alzheimer disease has posed a serious threat to human health. Fibril-forming motif is the core of the formation from native proteins to amyloid filaments. The deletion of itself fibril-forming motifs will cause Tau protein to lose its aggregation ability, while the insertion of unrelated fibril-forming motifs from other amyloidogenic proteins will retrieve its ability of forming fibrils with different structural features. In this study, we plan to construct human Tau mutants inserted by various heterologous fibril-forming motifs and seed one kind of Tau mutant by filaments formed from another. Biophysical methods will be used to identify their different structural features. We then overexpress different human Tau mutants in SH-SY5Y neuroblastoma cells or N2a neuroblastoma cells to detect the aggregation ability of these human Tau mutants. Quantum dots will be used to label different mutants of human Tau that enter neuronal cells to detect their apoptosis and pathological phosphorylation of endogenous human Tau. We attempt to analyze the structure of human Tau filaments on the molecular level and clarify the mechanism for the transmission of human Tau fibril structure, and thus provide new theory basis for the pathogenesis of Alzheimer disease. We determine the functions of these fibril-forming motifs by building transgenic mouse models with different fibril-forming motifs. We hope to demonstrate that fibril-forming motifs could be the determinants of human Tau protein tending to misfold in cells, thereby inducing neuronal apoptosis and causing the initiation and development of Alzheimer disease. We hope to develop small-molecule inhibitors for these fibril-forming motifs. Information obtained from this study should be useful in the development of new therapeutic regents for Alzheimer disease.

阿尔茨海默病等神经退行性疾病给人类健康带来了重大威胁，其重要病理特征之一是微管结合蛋白Tau错误折叠形成的神经纤维缠结。纤维形成片段是蛋白质形成淀粉样纤维的核心，Tau蛋白自身纤维形成片段缺失后失去生长纤维的能力，插入异源纤维形成片段后，突变体恢复长纤维的能力。本项目构建插入不同纤维形成片段的人Tau蛋白突变体，在体外以一种Tau蛋白突变体的纤维为种子诱导另一种Tau蛋白突变体长纤维，用生物物理方法鉴定不同种子诱导Tau蛋白形成纤维的结构特征；在神经细胞内过表达不同Tau蛋白突变体并观察其聚集；量子点标记不同Tau蛋白突变体进入神经细胞，检测神经细胞凋亡及内源Tau蛋白的病理磷酸化修饰；在分子水平上解析Tau蛋白纤维的结构，阐明人Tau蛋白纤维结构传递的机制；通过建立插入不同纤维形成片段的转基因小鼠模型确定纤维形成片段的功能，进而为阿尔茨海默病发病的分子机制及相关药物开发提供新的理论依据。

阿尔茨海默病等神经退行性疾病给人类健康带来了重大威胁，其重要病理特征之一是神经细胞内病理磷酸化修饰的微管结合蛋白Tau错误折叠形成的神经纤维缠结（NFT）。纤维形成片段是蛋白质形成淀粉样纤维的核心。人体内的Tau蛋白和锌离子都主要富集在人中枢神经系统神经细胞的轴突中。蛋白质二硫键异构酶（PDI）主要定位于内质网，但也定位在细胞质中。我们发现纤维形成片段PHF6和PHF6*双缺失导致可诱导的神经细胞中的Tau蛋白丧失了诱导内源Tau蛋白病理磷酸化修饰的能力，外源纤维形成片段重新插入后Tau蛋白恢复了诱导内源Tau蛋白病理磷酸化的能力。我们以病理突变体Tau-ΔK280的纤维为种子诱导野生型Tau蛋白长纤维，发现在Tau-ΔK280纤维种子的诱导下，野生型Tau蛋白积聚的速度显著加快，并且积聚速度随着种子浓度的增加而增加，这为NFT在阿尔茨海默病患者脑中逐渐扩散并加重病情的现象提供了实验证据。我们利用可诱导的细胞模型研究了病理浓度锌离子对全长Tau蛋白病理突变体Tau-ΔK280病理磷酸化修饰和积聚的影响，发现锌离子可以与全长Tau蛋白的Cys-291和Cys-322及其它两个氨基酸（His-330/362）形成四配位结构，使Tau蛋白获得某种倾向于积聚的构象，促进Tau蛋白的液-液相分离和积聚及细胞毒性；该聚集体能进一步诱导内源Tau蛋白病理磷酸化修饰和积聚，从而使得Tau蛋白毒性放大；半胱氨酸突变后，锌离子与Tau蛋白相互作用模式改变，四配位结构被打乱从而丧失了这种促进作用。我们还发现野生型PDI和只有分子伴侣活性的四半胱氨酸突变体都显著抑制了可诱导的细胞模型中全长Tau蛋白及其病理突变体Tau-ΔK280的病理磷酸化和积聚，并且显著降低了由Tau蛋白积聚导致的线粒体损伤及细胞毒性；Tau蛋白液滴选择性地募集了野生型PDI，但对巯基亚硝基化修饰的PDI（SNO-PDI）则没有招募作用，野生型PDI显著抑制了Tau蛋白的液-液相分离和应激颗粒的形成，而SNO-PDI则丧失了这种抑制作用。上述研究揭示了锌离子和PDI及其病理修饰对Tau蛋白液滴形成、积聚和毒性的调控机制及其在神经退行性疾病中的作用，也为阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关药物开发提供了新的理论依据。