蛋清溶菌酶作为朊蛋白错误折叠和淀粉样纤维形成机制的蛋白模型研究

The main problem of prion disease is the formation of amyloid fibrils from prion protein by conformational misfolding. Prion particles are unpurified and the components are complex, so it becomes the obstacle of study on prion protein amyloid fibrillization. Our project is to investigate whether Hen Egg-white Lysozyme (HEWL) could act as model protein for its characteristics of fibrillogenesis in the study of mechanism of prion protein amyloid fibrillization. Firstly, We attempt to make HEWL form into amyloid fibrils using the conditions of prion peptide PrP 106-126,the effect of amyloid fibrils are confirmed by β-sheet contents using Circular dichroism ( CD); to explore whether HEWL could form into amyloid fibrils using the technique of seeded conversion of prion protein, the concentration of HEWL fibrils is obtained by SDS-PAGE and coomassie brilliant blue staining; Then, the neuropathogenesis of HEWL fibrils is conformed by N2a cells. The significance of this project is to confirm HEWL as the model protein in the study of prion disease, further to explain the process of prion protein amyloid fibrillization by the mechanism of HEWL amyloid fibrillization, which further to understand the mechanism of prion protein amyloid fibrillization.

朊蛋白错误折叠和淀粉样纤维形成过程及机制一直是朊病研究领域的核心问题。至今为止发现的朊病毒颗粒是未经纯化的，成分不单一，这成为了该领域研究中的障碍。本项目拟应用蛋清溶菌酶的淀粉样纤维形成特性，探索其作为朊蛋白淀粉样纤维形成机制的蛋白模型材料。首先应用朊蛋白多肽PrP 106-126形成淀粉样纤维的理化条件使蛋清溶菌酶生成淀粉样纤维，生成效果采用圆二色谱技术测定的β-折叠含量变化鉴定；以微量蛋清溶菌酶淀粉样纤维作为种子，应用朊蛋白“种子转化”技术使蛋清溶菌酶生成淀粉样纤维聚集物，淀粉样纤维浓度采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测定；然后以N2a神经细胞评价蛋清溶菌酶淀粉样纤维的神经致病性。本项目的研究意义关键在于确定蛋清溶菌酶能够作为朊蛋白研究的模型材料，拟以蛋清溶菌酶的淀粉样纤维形成机制解释朊蛋白淀粉样纤维形成原因和过程，搞清楚朊蛋白错误折叠和淀粉样纤维形成机制。

朊蛋白经错误折叠形成淀粉样纤维及其致病机制是朊病研究领域的核心问题。由于朊病毒颗粒成分不单一，且朊蛋白多肽PrP 106-126序列短，不能用于分析蛋白错误折叠过程，因此本项目利用蛋清溶菌酶（hen egg-white lysozyme，HEWL）的淀粉样纤维形成特性，探索其是否可作为研究朊蛋白淀粉样纤维形成机制的蛋白模型。本项研究中，通过透射电子显微镜观察淀粉样纤维超微结构、硫黄素T荧光法和刚果红荧光吸收法测定淀粉样纤维形成和生长、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS) 测定疏水性、圆二色谱法测定二级结构转化，系统研究了蛋清溶菌酶淀粉样纤维形成过程中的影响因素等，并评价了蛋清溶菌酶淀粉样纤维对人神经细胞SH-SY5Y的细胞毒性。结果证明了蛋清溶菌酶蛋白淀粉样纤维的形成和生长过程受pH、温度等理化条件的影响，酸性pH、高温条件下较易形成淀粉样纤维；同时发现蛋清溶菌酶能够以朊蛋白“种子转化”的纤维生长方式进行生长；且极低浓度的淀粉样纤维显著引起了SH-SY5Y神经细胞的凋亡，并引起凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达变化。通过该研究，我们明确了蛋清溶菌酶能够形成与朊蛋白淀粉样纤维具有相似超微结构、生化属性和细胞毒性的淀粉样纤维，确定了蛋清溶菌酶蛋白可以成为体外研究朊蛋白错误折叠和淀粉样纤维形成机制的可靠模型蛋白质。