移植诱导多能干细胞源性中间神经元网络修复脊髓损伤的实验研究

Buoyed by the success in constructing a neural network with synaptic transmission function in our previous serial studies, here we aim to design an three dimensional interneuron network scaffold derived from induced pluripotent stem cells, with a inducible proliferating-cell-elimination mechanism to ensure the safety. Through a combination of multi-discipline approach such as biomaterial design and stem cell biology, this interneuron network will integrate into host neural network and serve as a “relay” to transduce the signals from above and below the injury level and hence this construct will envetually restore neural function after spinal cord injury.

本项研究在前期成功构建具有突触传递功能的干细胞源性神经网络支架的基础上，结合脊髓损伤病理生理学和创伤修复机制，采用三维生物支架与干细胞定向分化技术，旨在构建一种安全的诱导多能干细胞源性中间神经元网络。用于修复脊髓受损伤神经通路的结构与功能；同时阐明诱导多能干细胞源性中间神经元网络移植后在脊髓全横断损伤处与宿主脊髓整合、以信息“中继站”的形式修复脊髓自主运动功能的机制。这可为体外构建功能性类中枢神经组织及其移植修复脊髓受损伤的神经网络提供理论依据。

本项研究构建一种安全的诱导能干细胞（iPSCs）源性神经元网络支架，用于修复脊髓受损伤神经通路的结构与功能；同时研究证实诱导多能干细胞源性中间神经元网络移植后在脊髓全横断损伤处存活，保持神经元分化特性，并修复脊髓损伤后运动功能。其中诱导性多能干细胞的“安全性”是本研究的基础，也是制约本研究成败的关键技术因素之一。通过本研究，我们已经构建一种具有安全调控机制的诱导性多能干细胞株(iPSCs-TK)。此细胞株能保持诱导性多能干细胞的增殖，分化特性；同时此安全调控机制能够实现在体内外对仍增殖的干细胞进行删除，确保移植到体内的细胞都为已分化的细胞。此策略能提高诱导性多能干细胞的安全性。在此基础上，我们开发出一种组织工程方法，用于构建iPSCs来源的神经网络组织，并用它来治疗完全横断脊髓损伤（SCI）的大鼠。诱导iPSCs高度分为神经前体细胞，表现为90%以上的细胞表达神经前体细胞标记物Pax6和Nestin。将iPSCs-NPCs种植到三维明胶海绵支架材料。细胞呈现良好的活力。免疫细胞化学检测结果表明，iPSCs-NPCs大部分分化成熟的神经元。有些神经元的轴突在持续生长，并具有突触形成潜能，能表达突触成分蛋白。神经递质类型主要为胆碱能神经元表型，少部分为γ氨基丁酸。当培养基中添加视黄酸和音猬因子后，GABA能神经元比例增加至50%以上。这些结果提示iPSCs-NPCs来源的细胞具有神经元的表型。我们将神经前体细胞种植到三维支架材料后，膜片钳技术检测可检测到典型的动作电位。经过7天的培养，神经网络组织移植到大鼠全横断脊髓损伤区内，每日给予三联免疫抑制。结果表明运动功能从移植后4周开始恢复，移植后8周，神经网络移植组大鼠运动功能与对照组相比改善明显。病理分析显示，超过65%的移植细胞存活长达8周。并且大部分细胞持续表达神经元标记物。并通过与宿主的再生的神经纤维形成连接。这些结果表明，iPSC来源的神经网络组织可以功能修复受伤的脊髓。