内皮祖细胞“移植性诱导”内源性神经干细胞神经生发修复脊髓损伤的实验研究

神经干细胞（NSC）修复脊髓损伤（SCI）的实验研究主要分为外源性NSC移植和诱导内源性NSC两种方法，最新的观点认为外源性NSC移植本质上只是改善了SCI后的内环境，最终是通过内环境的改善而促进内源性NSC的神经生发达到修复效果。神经生发往往伴随着血管生发这一现象提示了血管因素在神经修复中的重要地位，有效的血管生发将带来微环境的明显改善而促进神经生发。内皮祖细胞（EPC）是在外周血中能够分离获得并能够有效促进血管生发的一种干细胞，课题组设计分离自体外周血EPC并移植入损伤的脊髓中，通过促进血管生发改善环境促进内源性NSC神经生发。研究通过EPC与NSC在体外的共培养、移植后内源性NSC及反应性星型胶质细胞的分化情况鉴定其对神经生发的促进作用，通过基因芯片技术鉴定血管生发相关基因的表达，通过BBB评分、鉴定VEGF等细胞因子的表达及神经再生情况等指标反映作用机制与对脊髓神经功能的修复作用。

本研究中取体重为90～120 g的雄性SPF级SD大鼠双侧颈动脉的血液，按照淋巴细胞分离液操作分离出单个核细胞层，离心获得的细胞沉淀以EBM-2完全培养基重悬，以5×105 /ml细胞浓度接种到含有预先FN包被过的盖玻片的24孔板中，37 ℃，5 % CO2的恒温培养箱培养。约9 d左右，细胞融合度达到约90 %后传代。细胞形态镜下观察符合铺路石样排列。经免疫组化鉴定能表达细胞表面抗原CD133及 VEGFR-2，摄取Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1双阳性，说明成功分离培养大鼠外周血EPCs。.将实验为NSCs培养对照组，EPCs与NSCs共培养组和抗VEGF组（加入VEGF抗体的EPCs与NSCs共培养组）。NSCs培养对照组：第3代NSCs, 吹打后接种于24孔培养板培养7 d,然后用5 %血清诱导培7 天。EPCs和NSCs共培养组：在对照组的基础上在孔内放置24孔板Transwell，取载有贴壁原代生长良好EPCs盖玻片，EPCs置于Transwell膜上，NSCs位于Transwell膜下，培养7 d，然后移走EPCs及Transwell膜，加5 %血清继续培养NSCs 7 d。抗VEGF组：在EPCs和NSCs共培养组的基础上再加入VEGF抗体，培养7 d，然后移走EPCs及Transwell膜，加5 %血清诱导继续培养NSCs 7 d。结果在7 d时可见，共培养组神经球数量比对照组明显多，而且球直径明显增大，共培养组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；5 %血清诱导培养NSCs 7 天后，行β-tubulin-Ⅲ免疫荧光染色，计数β-tubulin-Ⅲ+/细胞总数得出百分率，共培养组明显高于对照组（P<0.05）。.实验中将4月龄的 SPF 级 SD 大鼠随机分为EPCs移植组, NSCs移植组和对照组，每组 24 只。术前三天至术后一周每天BrdU(50 μg/g) 腹腔注射，采用改良 Allen法制备大鼠SCI模型后，EPCs移植组应用微量注射器在SCI处近端约0.5~1.0 mm注入EPCs 5 μl，细胞总数5×105/ml。NSCs移植组应用微量注射器在SCI处近端约0.5~1.0mm注入NSCs 5 μl，细胞总数5×105 /ml。对照组应用微量注射器在SCI处近端约0.5~1.0 mm注入生理盐水5 μl。 在术