神经活动对AMPA受体mRNA剪接和突触可塑性的影响

AMPA-type glutamate receptors (AMPARs) mediate the most fast excitatory neurotransmission in brain. The AMPARs on synaptic membrane play critical roles in regulating the transmission efficiency and synaptic plasticity. In order to pinpoint the molecular composition of synaptic AMPARs, we have previously developed single-cell genetics and shown that the synaptic AMPARs in pyramidal neurons are made of GluA1/A2 heteromers (Neuron, 2009). However, each AMPAR subunits could form flip/flop isoforms resulting from alternative mRNA splicing. Recent reports demonstrate that neural activity shaped AMPAR mRNA splicing, indicating change of synaptic AMPAR components and functions. To explore the precise roles that flip/flop type receptors play in synapse, we propose to isolate the AMPAR isoforms and study their synaptic function by targeting the specific DNA segments (exons) encoding the flop and flip isoforms using CRISPR-Cas9 techniques. This study will hopefully reveal the underlying mechanisms for synaptic plasticity induced by neural activity.

本课题希望精确、定量地揭示AMPA受体剪接亚型（flip/flop）对突触传递功能和可塑性的贡献。AMPA受体介导了脑内最主要的快速兴奋性神经传递。在以前的工作（Neuron，2009）中，申请者和同事发展了单细胞基因敲除法，阐明了脑内椎体神经元突触膜上的AMPA受体主要由GluA1/A2异源四聚体组成。然而，每种AMPA受体亚基由于mRNA剪接造成至少flip/flop两种亚型，使突触AMPA受体更加多样化。最近的报道表明受体编码mRNA的剪接受到神经活动的调节。那么如何从功能上区分突触上flip和flop类型的AMPA受体呢？本课题将借助新近发展的CRISPR-Cas9基因工程技术，特异性地剔除AMPA受体flip和flop的编码外显子，用遗传学方法分离出纯净的AMPA受体剪接亚型，并结合双电极电生理技术精确研究它们的突触功能，以深入理解突触受体可塑性变化受神经活动调节的机理。

AMPA-型谷氨酸受体（AMPA受体，AMPARs）介导了脑内绝大多数的快速兴奋性神经传递。突触膜上的AMPA受体对神经兴奋性、突触可塑性和神经网络活性起了关键的调节作用。突触AMPA受体功能的紊乱会导致神经发育异常、紊乱和疾病。经过二十多年的研究，现在对突触AMPA受体的生理功能已经有了相当多的理解。但是，但是我们对突触AMPA受体的分子构成以及其调节机制仍然理解得非常有限。在本项目中我们提出神经元的兴奋性活动调节AMPA受体编码mRNA的剪接（splicing），从而改变突触AMPA受体的分子构成，影响神经细胞的突触可塑性。在此假说的推动下，我们发展了基于CRISPR-Cas9的单神经元外显子剔除技术，并结合神经电生理方法，精确研究神经元活动引起的突触AMPA受体的分子构成和功能的变化。到目前为止，我们得出如下结论：.1..CRISPR-Cas9在神经元中基因编辑的效率非常高，配合电生理检测，我们估计其基因切割效率达到99%以上。.2..我们成功设计了针对GluA1、GluA2 以及GluA1 flip和flop的sgRNAs. .3..用胚胎电转方法可以成功将GluA2的flop和flip isoforms 剔除。剔除flop对于AMPAR受体整流效应的效果大于剔除flip的效果，表明CA1神经元flop的数量超过flip的数量。将两者相加的效果和剔除GluA2的效果一致，表明成功将flip 和flop敲除了..4..使用慢病毒介导的Cas9敲除的效率低于胚胎电转，预计需要等待更长的时间以使Cre和Cas9更强地表达。.因此，我们的工作探讨了新的基因编辑工具Cas9在神经细胞中剔除外显子的效率，为精确理解神经突触中谷氨酸受体的分子构成打下基础。通过课题的实施，我们发表了5篇高影响力的SCI论文，其中两篇通讯作者论文分别发表在PNAS（2016）和Sci REP（2017）上，两篇第二作者论文分别发表在PNAS（2017）和Elife（2015）上，还有一篇合作论文发表在Front Mol Neurosci (2017)。部分数据还在整理和发表中。一位参加本课题的博士后已经结业，一位技术员也已经去国外做博士后，毕业了一位博士生，还有2位博士和1位硕士生还在培养中。.