基于全基因组CRISPR/Cas9筛选系统解析人多能干细胞转变为神经上皮的细胞命运决定范式

The central nervous system of human is the highest hierarchical and the most complexed system in our body, which also is the most advanced system during evolution. However, It remains largely unclear how our brain is built during embryonic development. For example, the molecular mechanisms controlling the neural induction process by conversion of human pluripotent stem cells to neuroepithelia, which is the earliest cellular event during neural development, are elusive. Our group has defined that Pax6 is a hallmark gene for human neuroepithelia and is a key transcription factor for human neural induction. In this application, based on our well-established research platforms of human embryonic stem cells (hESCs) culture and in vitro neural differentiation, gene editing in human pluripotent stem cells, lentiviral production and infection, whole genome library screening, profiling and bioinformatics analysis, we are going to construct a Pax6-tdTomato reporter line in hESCs and screen for human neuroepithelium fate determination factors through CRISPR/Cas9-mediated gene knockout or transcriptional activation. We will then resolve screening results by using bioinformatics methods to reveal mechanisms that control the maintenance of pluripotency and neural fate differentiation. In combination with the genetic validation studies, we will also draw a fate conversion map during this early developmental event of neural induction. Through conducting this project, we expect to improve human neural differentiation of human pluripotent stem cells, promote fundamental research of human neural development, and benefit the translational research of stem cells.

人类神经系统是最高级最复杂的系统，其发育过程具有进化上的物种特异性，但是神经发育的第一次细胞学事件，即由多能性转变为神经上皮的细胞命运决定过程仍不清楚。我们实验室的前期研究发现，Pax6是人神经上皮发育的标志基因和关键调控转录因子。本课题借助我们成熟的人胚胎干细胞培养与神经分化平台、人多能干细胞基因编辑平台、慢病毒制备与感染平台、全基因组文库筛选平台、谱学与生物信息学平台，通过构建Pax6-tdTomato报告系统，利用CRISPR/Cas9敲除及转录激活系统对全基因组进行无偏好性筛选，然后利用生物信息学方法对筛选结果分析并行功能学验证，揭示人多能干细胞多能性维持、神经诱导的调控机制，并绘制多能干细胞和神经上皮命运转换的网络图谱。通此过项目的实施，有望揭示人神经早期发育的调控机制，描绘细胞命运转换的决定范式，并指导体外分化以及体内神经发育相关研究，推进神经科学的转化应用。

人多能干细胞的体外分化系统能够重现早期胚胎发育事件，为研究人类早期胚胎发育及发育相关疾病提供了很好的模型。人多能干细胞无法维持干性从而遵循默认模式向神经自发分化，这种由多能性转变为神经上皮的细胞命运决定过程是神经发育的第一次细胞学事件，但目前调控机制仍不清楚。人早期发育过程作为一个复杂而精细的发育学事件，涉及多种信号网络以及调控因子的协同作用，这就要求我们从全基因组的层面出发来研究问题。近年来，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术使得对人胚胎干细胞进行基因编辑、从全基因组层面系统性地研究基因的功能成为现实。. 为了系统追踪研究人多能干细胞早期分化这一重要事件，我们首先构建了敲入tdTomato红色荧光追踪神经上皮细胞标志基因Pax6表达的报告系统。其次我们在上述报告系统的细胞系中通过同源重组在AAVS1位点构建诱导过表达Cas9细胞系（Pax6-tdTomato/iCas9）。接着我们构建了针对人多能干细胞中所有蛋白编码基因和miRNA的全基因组gRNA文库，并感染Pax6-tdTomato/iCas9 人多能干细胞，流式筛选红色荧光的细胞。提取细胞基因组、建库并测序。. 利用生物信息学方法对筛选结果分析，我们鉴定了829个编码基因和85个miRNAs，构建了包括胚胎发育、细胞代谢过程、mRNA剪切转录、细胞周期、免疫反应、自噬、表观调控、细胞器定位8个功能模块的调控网络。胚胎发育模块中包含一些中内胚层分化核心基因，提示胚层核心基因之间的相互拮抗维持干细胞的多能性。表观调控模块中包括调控组蛋白修饰和染色质重塑的因子，提示其在细胞命运决定中起着重要作用。miRNA特异性靶向外胚层分化相关基因。代谢通路作为我们筛选到的最大的模块，其中的胆固醇合成的通路起到特异性抑制神经外胚层分化的作用。综上所述，通过谱系标记和CRISPR/Cas9全基因组文库筛选，我们成功构建了人多能干细胞全基因组功能筛选研究平台，并绘制了人多能干细胞维持与三胚层分化的调控模型。我们筛选获得的调控因子可作为人早期胚胎发育以及胚层分化的关键调控因子，为早期胚胎发育和干细胞研究提供了宝贵的资源。