脑血管重构过程中TMEM16A 参与脑血管平滑肌细胞迁移的机理及药物作用的研究

We have found that the expression and activity of TMEM16A chloride channel are decreased in cerebrovascular smooth muscle cells during hypertension, and negatively correlated with basilar artery remodeling. Smooth muscle-specific TMEM16A overexpression inhibited the development of hypertension-induced cerebrovascular remodeling. However, the underling mechanisms are still unknown. Our pilot experiments showed that overexpression of TMEM16A by adenovirus transfection inhibited AngII induced basilar artery smooth muscle cell migration. TMEM16A decreased AngII induced integrin expression and MLC20 phospharylation, as well as the translocation of G protein from cytosol to plasma membrane. In this study, we would like to use TMEM16A smooth muscle-specific knockout and overexpression hypertensive mice, together with the adenovirus transfection and gene mutation techniques, to investigate the relationship between TMEM16A regulated cerebrovascular remodeling and smooth muscle cell migration, the underling mechanisms, and the influence of drug treatment trargeting on TMEM16A. This study will provide very important data to identify that TMEM16A chloride channel is a new target for the development of new drug for the treatment of cerebrovascular remodeling and stroke, and to further explain the molecular mechanism of chloride channels effect on cerebrovascular remodeling.

我们已有工作发现脑血管平滑肌细胞TMEM16A氯通道表达和活性变化与高血压诱导的脑血管重构呈负相关，TMEM16A平滑肌特异性过表达可抑制脑血管重构的发展，但其机制尚不清楚。预实验结果显示TMEM16A过表达可抑制基底动脉平滑肌细胞迁移，降低AngII诱导的integrin表达和肌球蛋白轻链MLC20的磷酸化; 并可抑制G蛋白的胞浆胞膜转位。本项目拟在这些研究基础上，将TMEM16A平滑肌特异性敲除和高表达的AngII高血压小鼠整体实验与基因沉默、过表达和定点突变等离体实验结合起来，从分子和离子通道水平研究TMEM16A氯通道在脑血管重构中的作用与其调控平滑肌细胞迁移的关联性，其机制与信号通路；及影响TMEM16A的药物干预后的变化。为进一步阐明平滑肌细胞迁移在脑血管重构过程中的作用和机制，并为防治高血压脑血管重构及脑卒中等并发症的新药研发提供新靶点奠下基础。

脑卒中是危害最为严重的脑血管病之一，高血压发展过程中出现的血管重构是引起脑卒中的关键性病理变化。我们之前的研究发现，TMEM16A是脑血管平滑肌细胞Ca2+激活Cl-通道的分子基础，在双肾双夹诱导的高血压大鼠模型中，TMEM16A在脑血管平滑肌中的表达和活性随高血压的发展不断降低，并与脑血管重构程度呈现明显的负相关，提示TMEM16A参与了高血压脑血管重构的发生，可能是防治脑卒中的新靶标。然而，整体情况下，通过干预TMEM16A能否抑制脑血管重构的发生及其机制仍不清楚。在本项目中，我们采用TMEM16A平滑肌特异性过表达小鼠以及腺病毒转染TMEM16A siRNA和cDNA等技术，探讨该通道对血管紧张素II（AngII）诱导的脑血管重构的作用及其分子机制。结果发现，AngII诱导的高血压小鼠脑基底动脉发生重构，电镜显示血管平滑肌层排列紊乱，提示细胞发生迁移。在原代培养的脑基底动脉平滑肌细胞（BASMCs），AngII可诱导BASMCs迁移，而过表达TMEM16A显著抑制了细胞迁移。TMEM16A过表达抑制了AngII诱导的迁移相关信号通路RhoA/ROCK2的激活，以及肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）和肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化。但AngII诱导的肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的激活不受TMEM16A的影响。此外，在AngII刺激下，过表达TMEM16A可显著抑制BASMCs中Integrinβ3/FAK通路的激活和F-肌动蛋白的重排。与过表达TMEM16A的结果相反，沉默TMEM16A则促进了细胞迁移和这些信号分子的激活。与离体细胞实验结果相一致，在AngII诱导的高血压小鼠，平滑肌细胞特异性过表达TMEM16A减轻了血管重构，同时显著抑制了上述迁移相关信号的表达。进一步研究发现，TMEM16A对BASMC迁移信号的抑制作用是通过减少氯敏感的丝氨酸/苏氨酸激酶WNK1的激活来介导的，并与调控G蛋白的胞浆胞膜转运有关。综上所述，本研究表明TMEM16A抑制了AngII诱导的BASMC迁移，从而有助于保护高血压时的脑血管重构。该研究从分子水平、细胞水平和整体水平，探讨了TMEM16A氯通道表达变化调控血管平滑肌细胞迁移和高血压脑血管重构的新机制，并为评价TMEM16A能否成为防治脑血管重构和平滑肌细胞迁移相关疾病的新靶点提供实验依据。