生肌玉红膏对深Ⅱ度烧伤大鼠真皮多能干细胞的调控作用及基因芯片解析

Burn is a common body injury.Studies have shown that dermal multipotent stem cells (dMSCs) involved in tissue repair and structural reconstruction,a variety of growth factors can promote dMSCs proliferation and differentiation. Shengji Yuhong Ointment has long been used to burn and other wound treatment, but the mechanism is unknown. On the basis of our preliminary work, first,we establish a deep partial-thickness burn animal models to observe the influence of Shengji Yuhong Ointment on burn wounds and wound related cytokines and growth factors;secondly, by in vivo and vitro experiment,we observe the influence of Shengji Yuhong Ointment on dMSCs proliferation and differentiation for wound repair cells directly or indirectly through the effect of cytokines and growth factor expression; Finally, we use total gene expression profiling to analyse the regulation of Shengji Yuhong Ointment on dMSCs,and screen differentially expressed genes by deep partial-thickness burn animal model, demonstrate the hypothesis that Shengji Yuhong Ointment can promote wound healing through the regulation on dMSCs.The project establish the theoretical foundation for promoting application and clinical efficacy of Shengji Yuhong Ointment, and combined application of Shengji Yuhong Ointment with dMSCs for burn treatment,further enriches the connotation of traditional Chinese medicine in the treatment of burn wound.

烧伤是常见的机体损伤。研究表明真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells，dMSCs)参与组织损伤修复和结构重建，多种生长因子可促进dMSCs增殖分化。生肌玉红膏长期用于烧烫伤等各种创面治疗，但机制不明。本项目拟在我们前期工作基础上，首先建立深Ⅱ度烧伤动物模型，观察生肌玉红膏对烧伤创面的治疗作用及对相关细胞因子和生长因子表达的影响；其次，通过体内外实验观察生肌玉红膏直接促进或通过影响细胞因子和生长因子表达间接促进dMSCs增值及分化为创面修复细胞的作用；最后，运用全基因表达谱分析生肌玉红膏对dMSCs的调控作用并对筛选出的差异表达基因通过深Ⅱ度烧伤动物模型进行验证，论证生肌玉红膏可通过影响dMSCs而促进创面愈合的假说。本项目为该药膏的临床疗效和推广应用及今后生肌玉红膏联合dMSCs用于烧伤创面治疗奠定了一定理论基础，进一步丰富中医药治疗烧伤创面的内涵。

研究内容:首先，进行生肌玉红膏安全性实验研究；其次，观察生肌玉红膏对深Ⅱ度烧伤大鼠创面修复的影响。建立深Ⅱ度烧伤大鼠模型并给予相应药物治疗直至创面愈合。从组织病理学方面动态观察生肌玉红膏对烧伤创面修复的作用；再次，采用ELISA、免疫组化等方法于烧伤后不同时间点从炎症反应、氧化应激、生长因子等方面初步探讨生肌玉红膏促进烧伤创面愈合的可能机理；然后，采用“消化-贴壁-传代”的方法进行体外大鼠dMSCs的分离培养并观察其形态学特点，MTT检测dMSCs生长曲线，利用免疫组化法鉴定dMSCs及观察dMSCs多向分化情况；最后，用不同溶剂对生肌玉红膏进行萃取以确定合适的萃取溶剂，观察生肌玉红膏萃取物及生长因子TGF-β、VEGF、bFGF对大鼠dMSCs增殖分化的影响，ELISA及Q-PCR检测生肌玉红膏萃取物对大鼠dMSCs分泌生长因子的影响，针对TGF-β和bFGF序列设计相应的siRNA，分别敲降TGF-β和bFGF，检测生肌玉红膏对大鼠dMSCs增殖分化的影响。此外，在烧伤模型制备研究中出现烧伤程度过重的情况，鉴于此，我们采用血必净注射液对严重烧伤动物进行治疗并初步观察其疗效。 . 重要结果:生肌玉红膏无明显急性毒性、刺激性及过敏反应，是一种安全性较好的外用药。生肌玉红膏可加快深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合，其作用机制可能是通过抗氧化及抗炎作用、促进烧伤创面组织中生长因子VEGF、bFGF、TGF-β的表达，进而促进创面毛细血管的增生和成纤维细胞的增殖来发挥促进创面愈合的作用。本研究从幼龄大鼠真皮中成功分离出dMSCs，生肌玉红膏可促进大鼠dMSCs增殖及向成纤维细胞、表皮细胞分化；深入研究表明，生肌玉红膏可能通过与TGF-β和bFGF协同作用促进dMSCs增殖及分化。此外，对于严重烧伤大鼠，血必净注射液可通过调节炎症因子水平而保护重要脏器功能并具有一定的促愈作用。. 科学意义:本课题为生肌玉红膏的临床应用提供理论依据，使其有较好的应用前景，也为今后生肌玉红膏联合dMSCs用于烧伤创面治疗奠定了一定理论基础，进一步丰富中医药治疗烧伤创面的内涵，并促进祖国传统医学与现代医学紧密结合。