基于能量代谢调控的SAM和GSH联合高产机制研究

Energy metabolism is commonly found in various microbial reaction processes. Regulation of the levels and ratios of cellular cofactors related to energy metabolism will help to promote the over-production of energy-consuming synthetic bio-based chemicals. In this project, Candida utilis CCTCC M 209298, which can produce S-adenosylmethionine (SAM) and glutathione (GSH) simultaneously, is selected as the starting strain. Besides, several mutants with increased synthesis and consumption rate of intracellular NADH and (or) ATP will be constructed with C. utilis CCTCC M 209298 using genetic engineering techniques by overexpression of 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase gene (gapA) and ATP6 gene, together with knockout of mitochondria porins gene (Porlp). The key factors involved in intracellular energy metabolism regulation will be revealed through molecular biological methods as well as transcriptomics and proteomics approaches. Moreover, the differences in cell growth characteristics, material metabolism, intracellular microenvironments including pHi and redox state, the activities of key enzymes within EMP and TCA pathways, between the starting strain and the mutants will be investigated using cellular and molecular principles. Furthermore, the relationship between levels of NADH and ATP, ratios of NADH/NAD+ and ATP/ADP and the co-production of SAM and GSH will be revealed. The results of this project will not only help to realize the role of intracellular energy regulation on enhanced co-production of SAM and GSH, but also provide a novel idea for strain improvement and efficient production of other analogous energy-consuming products by microbial fermentation.

能量代谢普遍存在于各类微生物反应过程中，调控胞内与能量代谢有关辅因子的水平和比率，将有助于促进耗能合成的生物基化学品的过量合成。本项目以一株能发酵联产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和谷胱甘肽（GSH）的产朊假丝酵母CCTCC M 209298作为出发菌株，采用基因工程技术过量表达3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gapA）和ATP6基因，同时敲除线粒体膜孔蛋白Por1p基因，构建一系列胞内NADH和(或)ATP合成和利用速率明显提高的突变株。借助转录组学和蛋白质组学技术方法，解析参与能量代谢调控的关键因子。比较突变株和出发菌株在生长特性、物质代谢、胞内微环境（pHi、氧化还原状态）、关键酶活性等方面的差异，总结辅因子水平和比率与SAM和GSH联产之间的相关性。研究结果将有助于深入理解能量代谢调控在SAM和GSH联合高产中的作用机制，同时也为其他类似耗能发酵产品的高效生产及其菌株改良提供新的思路。

本项目以产朊假丝酵母为研究对象，利用基因工程技术对出发菌株C. utilis CCTCC M 209298进行遗传改造，筛选获得胞内能量代谢物质水平明显提高的突变株C. utilis Δpor1和C. utilis ATP6。主要研究成果包括：（1）敲除产朊假丝酵母线粒体膜上的por1基因，成功构建突变株C. utilis Δpor1。结果发现por1基因敲除提高了SAM合成酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性，提升了胞内NADH和ATP水平，突变株SAM和GSH的产量分别比出发菌株提高了28.4%和39.1%。转录组测序分析结果表明，por1基因敲除激活或上调了多种蛋白酶调控子以及能量代谢相关基因的表达。（2）将来源于拟南芥的ATP6基因过表达至出发菌株中，成功构建突变株C. utilis ATP6，结果发现突变株中的ATPase活性比出发菌株平均提高了31.4%；突变株胞内NADH和ATP水平明显提高，胞内SAM和GSH含量分别比出发菌株高出38.1%和20.8%。（3）发现弱酸胁迫有利于出发菌株合成GSH和对硒的富集，通过对酵母胞内关键酶活进行测定，发现弱酸胁迫不仅提高了GSH合成酶的活性，而且有助于提高酵母细胞的抗氧化能力。转录组测序分析结果表明，弱酸胁迫会激活或上调大量初级代谢、大分子代谢以及含氮化合物代谢，尤其是有机硒转化和GSH生物合成代谢，以及ATP合成途径相关的基因表达，从而进一步提高有机硒和GSH的含量及其在胞内的富集。（4）考察不同溶氧条件对SAM和GSH联产发酵的影响，结果发现30%的恒溶氧水平均有利于出发菌株和C. utilis Δpor1合成SAM和GSH。分批发酵过程参数分析结果表明，该溶氧水平不仅提高了SAM和GSH合成关键酶的活性，而且增加了胞内ATP的水平，为SAM和GSH的过量合成提供了充足的能量基础。（5）发现在分批发酵过程中添加丙酮酸钠可以促进SAM和GSH联合高产。实验结果表明，丙酮酸钠作为一种辅助能量物质，提高了SAM合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、己糖激酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，同时增加了胞内ATP的供给，为SAM和GSH过量合成提供了充足的能量物质。以上这些研究结果为类似耗能合成化合物的高效生产提供了可行的思路。项目执行期间，发表学术论文10篇，其中SCI收录6篇；申请国家发明专利3项；培养硕士研究生5名。