建立应用N端半胱氨酸多肽定量蛋白的方法及其在肝癌早期诊断中的应用

Based on the biological importance of cysteine and related proteins, the deficiency forcysteine-related proteinscreening method,as well as the lack of corresponding high-throughput, sophisticatedinformation accessibledetecting methods, this project aims to establish a reliablemethod to specifically screen and detectfree cysteineas well as protein and polypeptide containing N-terminal cysteine in plasma and other biological samplesusing CBT-basedClick condensationreaction.In our design, CBT is modified by conjugating the amino group with 6 × His tag or biotin labels, in order to achieve the enrichment, screening and purification oftarget peptide/protein through corresponding affinity method of the labels.Finally by liquid chromatography - mass spectrometry analytical tools, the content of eachproteinand peptide left after screening and enrichment can be determinedand all kinds of careful structural analysis can be achieved such as informationon protein modification.Ultimately, we aim toapplythe method for early clinical diagnosis, pathogenesis and drug treatment of liver cancer or even other diseases.

基于半胱氨酸及相关蛋白的重要生物学意义，对半胱氨酸相关的蛋白的筛选方法的不足，以及相应的高通量检测、精细信息获取方法缺乏，本项目的旨在建立一种可靠的利用CBT点击缩合原理特异性富集血浆及其他生物样本中游离的半胱氨酸以及含N-末端半胱氨酸的蛋白及多肽的方法，并通过在CBT上修饰6×His的组氨酸标签或者biotin标签，实现目的蛋白的富集、筛选、纯化，最后通过液相色谱-质谱联用的分析手段，对筛选后的各种多肽、蛋白的含量进行分别测定，并对各类蛋白后修饰进行细致分析，最终利用所开创的方法针对现有肝癌诊断标志物“甲胎蛋白、γ-谷氨酸转移酶同工酶Ⅱ”进行诊断，计算该方法的灵敏度、准确性及假阴性、假阳性率；同时针对现有生物标志物（甲胎蛋白、γ-谷氨酸转移酶同工酶Ⅱ）诊断不敏感，应用该方法发现新的生物标志物。

半胱氨酸残基在体内有着重要的生物学功能，其氧化、亚硝酸化等修饰均对细胞中的信号转导及细胞状态有着重要的调控作用。在多种疾病中，伴随着细胞功能的紊乱，细胞内这些半胱氨酸残基的修饰情况也发生着显著的变化。了解这些变化，无疑对疾病的检测，诊断，病理研究及治疗有着十分重要的意义。鉴于半胱氨酸相关蛋白的修饰的重要生物学意义和相关研究手段的缺乏，本项目开发出一种可靠的利用CBT 的缩合反应对细胞内含N-末端半胱氨酸残基的蛋白和多肽进行富集和分离的方法，通过一系列实验验证其选择性、灵敏度和准确性，用这种方法来作为肝癌早期诊断的新方法。该材料可以特异性吸附肝癌的肿瘤标志物甲胎蛋白胰蛋白酶酶切产物，可以提高现有诊断方法的灵敏度及特异性。同时可以利用这种材料来检测肝癌细胞中酶切后含N末端半胱氨酸残基蛋白的修饰及表达情况，并找出相关的与发病机理，进而为相关领域的研究提供条件，并为相关药物的开发奠定基础。