基于生精细胞周期及调控基因的表达探索菟丝子黄酮干预雷公藤多苷所致生殖损伤的机制研究

Glycosides of Tripterygium wilfordii(GTW) is an effective Chinese patent medicine in clinic for many diseases, but its procreative damage become a particular concern for medical practioner the research on the intervention for the procreative damage has the great importance. However, the most researches focus on the mature rats, hard to reflect the situations in the young rat. Our previous study has confirmed that GTW can depress the secretion of testosterone, promote the apoptosis of the testicular spermatogenic cells, decrease the number of the spermatogonia, spermatocytes and sperms. We also prove that the flavone of Semen Cuscutae has the good reparative ability on the procreative damage caused by GTW, but its mechanism is still uncertain. Therefor, on the basis of the previous research, this project will carry out the compared study on the mature rat and the young rat. By the detection of the spermatogenic cell cycle, CREM, SCF, C-myc and the reproductive ability, we hope to make certain that the flavone of Semen Cuscutae can repair the procreative damage caused by GTW, and the possible reparative mechanism maybe lies in its influnence on the spermatogenic cell cycle and the regulating its gene expression.This project can provide the measure and the basis in thory to the application of GTW in clinic, also can provide the experimental base and the study thinking to the premium medicinal development of Tripterygium wilfordii Hook. f.

雷公藤多苷片（GTW）是临床治疗多种疾病疗效显著的中成药，其生殖损伤是医学工作者关注的问题，研究干预生殖损伤的方法及机制具有重要意义。当前研究多集中在性成熟期大鼠，不能准确反映性发育期的幼鼠情况。我们前期进行了GTW对幼鼠的生殖损伤及补肾中药的干预研究，证实GTW可降低睾酮分泌、促进生精细胞凋亡、减少精原细胞、初级精母细胞和精子数量，并证实菟丝子黄酮对GTW的生殖损伤有较强的修复能力，但其机制尚不明确。因此本课题在前期研究基础上，开展幼鼠和成鼠的对比研究，基于生精细胞周期及关键调控基因CREM、SCF及C-myc表达及对生育能力的研究，确定菟丝子黄酮可提高GTW生殖损伤大鼠的生育能力，其机制可能为通过上调CREM、SCF基因、下调C-myc基因并延迟生精细胞向成熟期发育来实现。通过本研究可为儿科临床使用GTW提供干预手段和理论依据，并为开发副作用更小的复方雷公藤制剂提供实验基础和研究思路。

基于前期研究基础和认识，本研究以性成熟期前大鼠（3周龄）、成年大鼠（9周龄）为研究对象，以菟丝子黄酮干预雷公藤多苷所致不同发育时期生殖损伤和生殖能力为研究切入点。研究分两部分进行，体外实验采用原代睾丸生精细胞培养技术（分为5组），体内实验采用现代动物实验技术，幼鼠组与成鼠组分别设空白组、多苷组、黄酮组，共6组。 进行了以下指标检测：（1）原代细胞培养技术培养生精细胞，West Blot法检测细胞SCF/c-kit、CREM、C-myc蛋白表达，流式细胞技术检测细胞数量及细胞周期；（2）Real-time PCR方法检测了大鼠SCF/c-kit、CREM、C-myc的蛋白表达；（3）基因芯片和DNA高通量测序技术检测生精细胞发生的相关基因；（4）毒理实验技术雌雄大鼠合笼方法观察配对雌鼠的受孕率、产仔数、产仔时间。研究结果显示：（1）不同剂量的雷公藤多苷对生精细胞具有一定的损伤，但其增殖能力仍保持在一个相对较高的水平。（2）菟丝子黄酮通过以下环节和靶位发挥作用，如影响单倍体及二倍体细胞群数，修复生精细胞S期，降低体外培养的生精细胞凋亡数量，上调实验大鼠SCF、c-kit的表达，下调生精细胞调控基因C-myc的表达，减少生精细胞凋亡。（3）研究结果表明雷公藤多苷可上调大鼠C-myc的表达，升高生精细胞的凋亡率，下调SCF/c-kit和CREM蛋白量的表达。但雷公藤多苷对于幼鼠、成鼠的影响无明显差异。（4）合笼数据结果表明，雷公藤多苷可降低雄性大鼠所配对的雌鼠的受孕率，但停药后可恢复到90%以上，经过菟丝子黄酮干预后，其幼鼠黄酮组与成鼠黄酮组的受孕率达到了100%，具备了正常的生育功能。（5）基因检测证实菟丝子黄酮可以使大量的基因表达上调。该研究明确了GTW对成鼠和幼鼠生殖损伤均为可逆的，菟丝子黄酮具有很好的保护生殖的功能，同时作用靶位较明确，该研究为开发副作用更小的复方雷公藤制剂提供实验基础和研究思路。该课题历时四年完成，发表期刊论文3篇（含正在修稿1篇），研究生论文5篇，培养硕士5人，科室骨干4人。