β-防御素衍生物的分子设计及生物学活性研究

为了解决抗生素残留及微生物对其产生的耐药性问题，在保证动物生产性能的前提下，为人们提供健康绿色的畜产品，利用生物信息学方法预测抗菌肽结构参数的基础上，通过截取、二硫键删减、氨基酸残基替代等方法，得到鸡β-防御素抗菌肽的一系列衍生物，对这些衍生物进行体外生物学活性检测，初步揭示抗菌肽的长度、电荷数、疏水性、二硫键有无等因素对β-防御素构效关系的影响，为抗菌肽的分子设计提供理论依据。利用筛选得到的具有较高活性的抗菌肽衍生物进行仔鸡体内试验，探讨抗菌肽对肉仔鸡免疫和其他功能的影响，从而为抗菌肽及其衍生物的应用奠定基础。

本项目按照原计划完成了各项任务，主要研究了β-折叠抗菌肽结构与功能关系，并探讨其体内外的生物学活性和抑菌机理。. 从抗菌肽的氨基酸组成及结构特点出发，通过疏水性残基缬氨酸和阳离子残基精氨酸为骨架，设计得到全新的β-发卡抗菌肽；同时还对天然抗菌肽鸡β-防御素-4（AvBD4）进行了改造，得到了一系列衍生肽。项目对这些抗菌肽的体内、外生物学活性，包括抑菌活性，溶血活性，细胞毒性、稳定性等进行了测定，并通过抗菌肽与细菌细胞膜间的相互作用，探讨了抗菌肽的作用机理。结果显示，随着发卡片层长度的增加，抑菌活性先升高后降低，呈二次曲线关系，而细胞毒性也随片层长度的增加而提高。VR3展示出最强的抗菌活性和最低的细胞毒性，具有较高的细胞选择性。随着XR系列肽片层长度的提高，抑菌活性和细胞毒性均有增大的趋势。含有脂肪族氨基酸I的IR2具有最大的细胞选择性。线性AvBD4（RL38）具有较高的杀菌活性，并且不同长度的截取肽GL23、GL18及GL13仍然具有杀菌活性，发现GLI23和GLI13-5的治疗指数最高，具有较大的细胞选择性。多肽VR3、IR2、GLI23和GLI13-5在经过不同盐离子、蛋白酶及高热处理后仍然具有不同程度的抑菌活性；通过CD谱对抗菌肽的二级结构进行分析，抗菌肽在疏水环境中发生了结构变化，或α螺旋或β折叠结构。体内实验表明，抗菌肽VR3在体内仍然能够明显抑制由沙门氏菌感染所致的脓毒症，并表现出剂量效应。肽膜试验显示，抗菌肽通过与细胞膜发生作用而杀死细菌微生物。根据酵母系统密码子的偏爱性，设计了抗菌肽GLI23和AvBD-6的编码基因，成功构建了重组表达载，通过电转化的方式转入到宿主毕赤巴斯德酵母，对表达产物进行了活性检测。抑菌效果表明，表达产物具有不同程度的抑菌活性。将AvBD-6基因表达产物添加到肉鸡的日常饮水中，结果表明，重组AvBD-6能够显著提高肉鸡的平均日增重，降低料重比，能显著降低肉鸡盲肠内大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和总需氧菌的数量，并能使有益菌双歧杆菌的数量显著提高。本项目在探索抗菌肽的研究方法及新型抗菌肽在临床及畜牧业中的应用提供借鉴和参考。. 项目发表论文20篇，其中SCI收录16篇。申请专利1项，授权专利2项。培养博士后1人，博士2人，硕士6人。