α-螺旋抗菌肽的分子改良、抑菌机理和真核表达的研究

Our team has reformed the amino acids sequence and structure of beta-defensin antimicrobial peptides and explored the relationship between structure and function of β-sheet antimicrobial peptide. Some ideal antimicrobial peptides have been screened. In this study, α-helical antimicrobial peptides derived from pigs were chosen to further study the structure-function relationships for comprehensive evaluation of antimicrobial peptides. Pig α-helical antimicrobial peptide was reformed with the methods of the length shortening, amino acid substitutions, the helicity adjustment, cyclization, the C-terminal amidation, or N-terminal acetylation to obtain a series of derivatives of the pig α-helical antimicrobial peptide. Then the biological activities of these derivatives will be evaluated in vitro and in vivo. These results will reveal the effects of many factors, such as the length, charge, hydrophobicity, and secondary structure on function-activity relationships of the antimicrobial peptides. Screened antimicrobial peptides will be expressed in Pichia pastoris to explore the feasibility of high-throughput expression of the antimicrobial peptides in eukaryotic cells. The research will further lay the foundation for the application of the α-helical antimicrobial peptides to substitute antibiotics in pig production.

本课题组已于前期对β-防御素抗菌肽进行了结构改造，探讨了β-折叠抗菌肽结构和功能的关系，并筛选得到了较为理想的抗菌肽。为了进一步探讨α-螺旋抗菌肽的构效关系，本研究以猪源α-螺旋抗菌肽为研究对象，通过对此α-螺旋抗菌肽进行分子改良，主要包括长短截取、氨基酸残基替代、螺旋度的调整、环化、二聚化、C-端酰胺化或N-端乙酰化等方法，得到猪α-螺旋抗菌肽的一系列衍生物，并对这些衍生物进行体外生物学活性检测，以揭示抗菌肽的长度、电荷数、疏水性、两亲性、结构修饰等因素对α-螺旋抗菌肽结构和功能的影响。将得到的优异抗菌肽进行小鼠感染模型试验，进一步探索抗菌肽的动物体内生物学活性，为抗菌肽的临床应用提供依据。并对筛选出来的生物学功能优异的抗菌肽进行毕赤酵母真核表达，以探索抗菌肽真核高通量表达的可行性，构建成熟的酵母表达平台，为猪源α-螺旋抗菌肽用于替代饲用抗生素奠定基础。

本课题组已于前期对β-防御素抗菌肽进行了结构改造，探讨了β-折叠抗菌肽结构和功能的关系，并筛选得到了较为理想的抗菌肽。本研究以猪源α-螺旋抗菌肽为研究对象，探讨了α-螺旋抗菌肽的构效关系；对抗菌肽进行毕赤酵母真核表达，以探索抗菌肽真核高通量表达的可行性，构建成熟的酵母表达平台。.猪源骨髓抗菌肽PMAP-36是cathelicidins的一种，带有13个正电荷性氨基酸。以此为模板，首先合成了截取自PMAP-36 N端24个氨基酸残基的衍生物GI-24。GI-24包含了PMAP-36的整个α-螺旋区域和全部的阳离子氨基酸残基。PMAP-36及其衍生物当有SDS和三氟乙醇（TFE）存在时都呈典型的α-螺旋结构。C末端12个氨基酸的缺失并没有影响PMAP-36的抗菌活性，表明PMAP-36的活性中心位于其N末端。当用亮氨酸和苯丙氨酸替代GI-24第23位的色氨酸时对其抗菌活性没有影响，但用赖氨酸和丙氨酸替代时抗菌活性显著降低，表明一个高疏水性的氨基酸残基在GI-24的第23位上对其抗菌活性非常重要，但是天然肽中的色氨酸并不是必须的。所有的抗菌肽对机体正常细胞的毒性都非常低，比作为对照肽的melittin具有更高的细胞选择性。与中性的脂质体（模拟哺乳动物细胞膜）相比，PMAP-36和GI-24对带负电荷脂质体（模拟细菌细胞膜）的偏爱作用与其高活性低毒性相一致。结合膜的透化、流式细胞仪、激光共聚焦扫描显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜试验，结果表明PMAP-36及衍生肽比melittin更强的破坏细菌细胞膜的能力。.根据毕赤酵母的密码子偏爱性，设计了PMAP-36二聚体(PMAP-36)2的编码基因，将基因序列进行全基因合成；将目的基因连接到真核表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体，以1% (v/v)的甲醇诱导表达。考马斯亮蓝法测定上清蛋白含量为106 mg/L。表达产物对大肠杆菌25922的MIC值为12.5 µg/mL，对金黄色葡萄球菌25923的MIC值为25 µg/mL；溶血活性试验结果显示表达产物无溶血活性；体内试验结果表明，表达产物能够提高AA肉仔鸡血清IgM值，对IgG无显著影响；与对照组相比能够显著降低大肠杆菌数量（P<0.05），显著提高双歧杆菌数量（P<0.05），但是对沙门氏菌和乳酸杆菌无显著影响。