矿物元素锌与其跨膜转运蛋白相互作用机制研究

Zinc is the second most abundant essential microminerals (after iron) in humans, and zinc is comprehensively involved in a variety of biological processes by playing structural and catalytic roles in macromolecules. Zinc deficiency causes many health problems, whereas, excess zinc is toxic. Accordingly, a sophisticated control of systemic and cellular zinc homeostasis is vital for life. In human, among all the 14 ZIPs, ZIP4 plays an indispensable role in dietary Zn absorption in the small intestine, and it is expressed at the apical membrane of enterocytes. As a transporter, ZIP4-ECD directly interact with exogenous Zn, and ZIP4-TMD transport across cell membrane through conformation shift. However, the molecular mechanisms of Zn and ZIP4-ECD interaction is not clear. In this proposal, we focus on the ZIP4-ECD structure changes induced by Zn binding, kinetic parameters, and thermodynamics parameters during Zn binding process. Further, we are going to evaluate the biological significances of the interactions between Zn and hZIP4-ECD. Ultimately, these studies will facilitate the understanding of Zn uptake through ZIP transporter, establish the mineral elements nutrition research methods, and provide the theory instruction for functional food development.

矿物质元素锌是人体内第二大微量元素，与人体健康密切相关，然而过量的锌又会对人体产生危害，因此人体内锌含量必须受到严格调控来维持体内稳态平衡。食品中锌主要通过位于小肠绒毛上皮细胞上的跨膜转运载体（ZIP4）进行吸收，ZIP4胞外可溶性部分（ZIP4-ECD）首先与锌进行结合，然后再通过跨膜区域（ZIP4-TMD）的构象改变转运锌进入细胞当中。但是，目前锌与ZIP4-ECD相互作用研究国内外还未见报道。因此，本项目以ZIP4-ECD为研究对象，旨在通过研究锌与ZIP4-ECD相互作用过程中蛋白质结构变化、锌与蛋白质相互作用过程中的热力学与动力学参数，阐明锌与ZIP4-ECD相互作用机制，并进一步研究此相互作用对锌跨膜转运的生物学意义。通过本课题的开展加深矿物元素锌跨膜转运吸收机理研究，建立微量营养元素在体内分子营养研究方法，为开发安全高效的锌元素营养补充制剂提供理论指导。

锌在人体内蛋白质结构稳定、生物催化和信号调节中起着至关重要的作用，缺锌会导致许多器官和免疫系统的功能障碍，而过量的锌离子又会带来毒副作用。食品中的蛋白质对锌吸收有明显的影响，主要是通过与小肠上皮细胞中ZIP4蛋白胞外可溶区域与食品蛋白质相互作用而进行锌离子竞争性结合，吸收食品中锌元素。本研究首先克隆表达了一个哺乳动物ZIP4的胞外可溶区域pZIP4-ECD，并利用滴定量热方法算出了其与锌离子的结合强度。其次本研究从乳清蛋白中选择了三种主要成分：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白，经实验验证它们以不同的结合强度与锌结合。在细胞实验中蛋白质结合消除了游离锌的毒性作用，并且蛋白质与锌离子不同的结合强度与其对锌离子通过ZIP4跨膜吸收效率存在相关性。结果显示，结合强度较低的β-乳球蛋白能促进锌的吸收，结合强度与pZIP4-ECD相当的α-乳白蛋白对锌离子吸收几乎没有影响，而结合强度较高的牛血清白蛋白降低了Caco-2细胞系对锌的吸收。通过结合三种蛋白质与锌离子结合强度及其对锌离子吸收的影响，得出蛋白质对锌离子的结合方式、结合强度主导了食品中蛋白结合锌通过ZIP4跨膜转运吸收。该研究还利用荧光光谱和X-射线晶体衍射方法系统研究了锌离子与蛋白质结合方式以及结合构象。研究结果对开发锌元素补充制剂具有指导意义。