苹果跨膜转运蛋白在S-RNase转运中的作用机制研究

S核酸酶作为花柱S决定子，在配子体自交不亲和反应中参与花柱花粉间信号识别。实验证明苹果S核酸酶产生在花柱引导组织细胞(TTc)内，在花粉管刺激下S核酸酶由花柱TTc内向细胞间及花粉管内转运，发生自交不亲和反应，而S核酸酶如何通过花柱TTc膜和花粉管膜尚不得而知。前一基金申请者利用酵母双杂交筛选到一批与苹果花柱S核酸酶互作的蛋白，其中包括花柱中的ABC跨膜转运蛋白和花粉中糖类转运蛋白B16片段。该项目予在此基础上，首先利用RACE得到其基因全长，软件分析其基因结构，进行进化与组织特异分析，并确定2种蛋白是否定位于苹果花柱TTc或花粉管膜上，通过药物阻断实验初步证明转运蛋白作用，再利用RNAi技术将由花粉和花柱特异性启动子构建的2种蛋白基因载体导入杂交矮牵牛中，沉默膜对应基因，通过分析转基因矮牵牛异花授粉后2种转运蛋白及S核酸酶在花柱细胞和花粉管内的表达，从而揭示苹果花柱S核酸酶跨膜转运机制。

苹果等蔷薇科果树中存在由S基因座控制的配子体自交不亲和现象，S基因座主要包括S-RNase和F-box。SI反应的发生主要是由花柱S-RNase进入花粉管发挥细胞毒性作用阻止自我花粉管生长引起的生殖隔离现象。因此，花柱产生的S-RNase如何进入花粉管就成为一直以来研究中的谜团。本项目在前期基础工作中，通过以S-RNase为诱饵，利用酵母双杂交筛选，从苹果国光‘花粉’cDNA文库中获得了一个具有跨膜转运功能的ABC基因片段，推测其可能与S-RNase运输机制相关。因此，围绕苹果S-RNase跨膜转运机制，我们对ABC蛋白进行了结构分析、生化性质、转运功能研究及转基因验证，终于揭开了苹果ABC跨膜转运蛋白在骨架协同作用下运送S-RNase至花粉管囊泡导致自交不亲和反应的谜团，主要研究结果如下：.1.苹果花粉ABC基本性质分析。酵母转化和pull-down验证了ABC与S-RNase互作；NCBI保守域CD-Search分析将其命名为MdABC；RT-PCR表明花粉中其表达量最高；花粉基因枪法将其转入‘国光’花粉及利用PEG转化玉米原生质体，均显示其在细胞质膜上表达。.2.证明ABC能够影响苹果花粉管对S-RNase的运输。反义寡核苷酸转染沉默花粉MdABC表达，发现添加S-RNase培养花粉管后，花粉生长长度显著高于未沉默ABC的对照；利用FITC-S-RNase培养花粉，发现S-RNase荧光点在花粉管内，但沉默MdABC表达的花粉管内未观察到。.3.S-RNase的运输不具有S单元型特异性。酵母双杂证明ABC与不同S单元型核酸酶互作；添加FITC-S1、RBITC-S2-RNase培养苹果自交后代纯合体花粉，在沉默MdABC表达花粉管内观察不到S-RNase荧光点。.4.花粉管细胞骨架对于S-RNase运输起重要作用。利用微丝、微管相关药品与S-RNase同时处理花粉管，萌发和生长长度均显著高于对照花粉管。利用FITC-S-RNase培养微丝药品处理后的花粉管，发现花粉管内少见S-RNase荧光点；自交授粉发现Taxol处理的花粉在花柱中的生长长度远高于对照。.5.矮牵牛转基因实验验证了ABC对自交亲和性影响。叶盘法转基因将过表达ABC及沉默PhABC载体转入自交不亲和矮牵牛，发现仅沉默ABC的矮牵牛能够打破原有自交不亲和性。