基于蛋白质分子结构的极端嗜热α -淀粉酶的高温适应性机制研究

Development of thermo-stable α-amylase is the urgent need of the starch liquefaction process. Research on thermal adaptation of hyperthermophilic α-amylase can provide theoretical guidance to improve thermo-stablity of α-amylases. PFA is characterized as the most thermostable α-amylase and BLA is the most widely used α-amylase in starch hydrolysis process. Based on similarity in structural characteristics and catalytic mechanism, gene shuffling is used to generate hybrids between PFA and BLA. The key regions for thermo-stablity of PFA and BLA are identified by comparing thermo-stablity of the hybrids, PFA and BLA. Further, site-directed mutagenesis is used to construct point mutants to identify important residues associated with thermo-stability of PFA and BLA. Then, the tertiary structures of mutants with significantly different properties are simulated. Molecular basis of thermal adaptation of PFA and BLA are revealed by analyzing the enzymatic properties and tertiary structure of mutants. This study can further our unstanding of protein thermal adaptation. Moreover, this can provide effective strategies for commercial production of α-amylase of improved thermo-stability.

开发耐高温α-淀粉酶是目前淀粉液化工艺的迫切需要。极端嗜热α-淀粉酶的高温适应性机制研究可以为构建热稳定的α-淀粉酶提供理论指导。PFA是目前已知的热稳定性最好的α-淀粉酶，BLA是工业上最常用的α-淀粉酶。本项目基于PFA、BLA的蛋白质分子结构和催化机制的相似性，采用基于蛋白质分子结构的基因重组技术构建PFA、BLA的杂合酶，通过比较杂合酶与PFA、BLA的热稳定性，确定对PFA、BLA热稳定性起关键作用的结构区域。进一步采用定点突变技术构建与关键结构区域相关的点突变体，确定对PFA、BLA热稳定性起关键作用的氨基酸残基。然后对性质差异明显的突变体进行蛋白质三级结构模拟，并结合突变体的性质和模拟的蛋白质三级结构阐明PFA、BLA高温适应性的分子机制。本研究有助于了解蛋白质类生物大分子高温适应性的分子机制，也将为构建具有优良高温活性和热稳定性的α-淀粉酶提供新的理论依据和设计思路。

极端嗜热α-淀粉酶具有反应温度高、液化速度快、热稳定性好以及对Ca2+依赖性小等特点，在淀粉液化工艺中具有较高的应用价值。并且极端嗜热α-淀粉酶可以作为研究蛋白质热稳定机制的分子模型。针对极端嗜热α-淀粉酶的开发及应用研究，不仅可以为淀粉工业提供具有优良性质的α-淀粉酶，而且有关其高温适应性机制的研究也将为构建具有优良高温活性和热稳定性的α-淀粉酶提供新的理论依据和设计思路。本项目对比、分析PFA和BLA的蛋白质分子结构，采用基于蛋白质分子结构的基因重组技术构建PFA和BLA的杂合酶，并通过比较杂合酶与PFA、BLA的高温活性和热稳定性确定对PFA、BLA热稳定性起关键作用的结构区域。其中，针对于BLA热稳定性起关键作用的结构区域包括：结构区域III（包括部分结构域A与结构域B）、结构区域V（包括部分结构域A）、结构区域VI（包括部分结构域A与结构域C）；针对于PFA热稳定性起关键作用的结构区域包括：结构区域III（包括部分结构域A与结构域B）、结构区域VII（包括部分结构域C）。参照PFA、BLA的蛋白质分子结构，分析关键结构区域中与蛋白质热稳定性相关的氨基酸残基，采用定点突变方法构建与关键结构区域相关的点突变体，包括Ca2+结合位点突变体和离子键突变体。通过分析点突变体的酶学性质和蛋白质分子结构，阐明PFA、BLA高温适应性的分子机制：1、BLA中domain B的Ca2+-Na+-Ca2+三金属离子结合位点对于BLA维持热稳定性非常重要，与文献报道相符；domain A与domain C之间的Ca2+结合位点对于BLA维持热稳定性非常重要，已通过实验证实；2、PFA中domain B的Ca2+-Zn2+双离子结合位点、domain C中二硫键对于PFA维持热稳定性非常重要，与文献报道相符；各结构区域中离子键对于PFA维持热稳定性非常重要，已通过实验证实。此外，本项目实现了PFA在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达，并定向改造了极端嗜热α-淀粉酶ApkA的高温活性和热稳定性。本项目研究成果有助于了解蛋白质类生物大分子高温适应性的分子机制，也可以为构建热稳定的α-淀粉酶提供理论指导。