基于晶体结构的超嗜热古菌高温α-淀粉酶热稳定性不依赖钙离子的分子机制研究

Most of the microbial α-amylase used in industry require addition of calcium ion (Ca2+) for their thermostability. Few microbial α-amylase thermostability does not depend on Ca2 +. It is a conspicuous drawback in the application of enzymes for the deep processing of starch. The acquirement of α-amylases which have good thermostability and don't require addition of Ca2+ for its thermostability is one of the most effective way to resolve the problem. A extremely thermophilic anaerobic archaeon strain, HJ21, from a deep-sea hydrothermal vent, could produce hyperthermophilic α-amylase(TSA) that do not require Ca2+ for thermostability. There are no research reports for the principle ofα-amylase thermostability not depinging on Ca2 + and the difference of crystal structures between the two kind of α-amylase yet. The purpose of this project is to investigate the molecular mechanism of the hyperthermophilic α-amylase of the marine hyperthermophilic archaea that does not require Ca2+ for thermostability by analyzing their crystal structure determined by X-ray single crystal diffraction of the TSA. Then point mutation will be produced on the key amino acid for the TSA do not require Ca2+ for thermostability. The mutant enzymes will be purified and characteried to confirm the validity of the results. The results would be establish the principle and experiment foundations for the application of rational enzyme design to design α-amylase do not require Ca2+ for thermostability used in industry.

大部分微生物的α-淀粉酶的热稳定性依赖Ca2+，仅有少数菌分泌的α-淀粉酶热稳定性不依赖Ca2+。目前工业应用的高温α-淀粉酶热稳定性依赖Ca2+是淀粉深加工的瓶颈，获得热稳定性不依赖Ca2+的高温α-淀粉酶是解决该问题的最有效途径之一。本研究组发现一株超嗜热古菌所分泌的高温α-淀粉酶（TSA）热稳定性不依赖Ca2+。关于酶的热稳定性不依赖Ca2+的机制以及这两种酶的蛋白晶体的结构异同，尚无研究报道。本研究拟通过制备TSA晶体，测定和分析TSA晶体结构，并与热稳定依赖Ca2+的其他α-淀粉酶的晶体结构进行比较分析，来研究TSA热稳定性不依赖Ca2+的分子机制。并通过对TSA中热稳定性不依赖Ca2+的关键氨基酸进行定点突变，验证所获得的分子机制。以期对一些热稳定性好、但热稳定性依赖Ca2+的α-淀粉酶进行分子改造，为获得适用于淀粉制糖工业的高温α-淀粉酶提供依据。

α-淀粉酶是一种可以随机水解淀粉分子内部的α-1,4糖苷键的内切酶，是重要的工业酶制剂之一。用在淀粉加工的α-淀粉酶的理想条件是pH 4.5和105℃。目前主要工业用的是Bacillus licheniformisα-淀粉酶（BLA），BLA的最适作用条件为90℃和pH 6, 存在的主要问题是热稳定性差，高于100℃和pH低于6.0时易失活，热稳定性依赖于钙离子，导致淀粉液化时需调节pH，添加钙离子，并在后续工艺排除钙离子。获得热稳定性不依赖钙离子的高温α-淀粉酶是解决该问题的最有效途径之一。本研究发现一株海洋超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21分泌的超嗜热α-淀粉酶（TSA）的最适作用温度为95℃，最适合pH为5.0，且热稳定性不依赖钙离子。本研究以TSA为研究对象，克隆并重组表达了TSA基因，对重组酶进行纯化后，采用气象扩散法，在室温进行结晶条件优化，获得最佳TSA晶体形成条件。培养一周后TSA晶体尺寸为0.2mm×0.1mm×0.1mm。通过X-射线衍射法测定获得了分辨率为1.0 Å TSA的晶体结构，发现TSA蛋白结构属于典型糖苷水解酶家族 13 ( glycoside hydrolase family 13 , GH13)，有Domain A，Domain B和Domain C 3个结构域，中间为 (α/β)8桶状结构，结合有3个钙离子和两个Zn2+，有5个氨基酸和钙离子相结合。比较分析TSA蛋白晶体结构与其超嗜热古菌Pyrococcus woesei高温α-淀粉酶（PWA），以及Bacillus licheniformis的α-淀粉酶（BLA）的晶体结构，推断TSA热稳定性不依赖额外添加钙离子的7个氨基酸位点，进行定点突变。同时，利用易错PCR和DNA shuffling技术定向进化TSA，获得热稳定性提高，仍不依赖额外添加钙离子的突变体。结合TSA、PWA、BLA晶体结构比对分析结果，以及突变酶的序列分析，初步确定TSA热稳定性不依赖额外添加钙离子的机制是TSA蛋白中钙离子起到稳定蛋白结构，提高热稳定性的作用，TSA中钙离子和氨基酸的结合十分牢固，在纯化的过程中，钙离子不会丢失，因此不需要添加额外钙离子维持热稳定性。随后用EDTA螯合试验和钙离子添加试验对机制进行了验证。本研究为淀粉酶的分子改造，从而获得工业用淀粉酶奠定了基础。