间充质在哺乳动物耳蜗毛细胞再生中的作用

Hearing loss is one of the most common disabilities in humans.The lack of regenerative potential of cochlear hair cells is the main cause of permanent hearing loss and regeneration of cochlear hair cells has been considered to be the ultimate remedy. In non-mammalian vertebrates, such as birds, The key factor of hair cells regeneration is that supporting cells can divide and transdifferentiate into hair cells and replace lost hair cells as a consequence of injury, disease, or age-related deafness. Mammalian supporting cells and hair cells, however, do not regenerate and replace lost hair cells. Our preliminary studies showed that mesenchymal tissue located adjacent to developing cochlear epithelium plays an important role in the morphogenesis and cytodifferentiation of the mouse auditory epithelium, which suggested the potential of mesenchymal tissue in activating the regeneration of cochlear hair cells. In this project, we will investigate the effect and mechanisms of mesenchymal tissue on proliferation and differentiation of presensory cells in developing auditory epithelium culture in vitro.Further， we will purify neonatal cochlear supporting cells by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using Math1/nGFP transgenic mice.

感音神经性耳聋是影响人类健康和生活质量的重要因素之一，其主要原因是耳蜗毛细胞损伤，激活耳蜗毛细胞再生是最佳的治疗方法。支持细胞增殖分化或转分化为毛细胞是鸟类等低等动物毛细胞损伤修复的关键因素;但在哺乳动物，耳蜗感觉前体细胞分化为支持细胞和毛细胞后，终生缺乏再生能力。我们初步研究发现胚胎期小鼠耳蜗感觉上皮相邻的间充质对耳蜗感觉上皮的形态发育及感觉前体细胞增殖分化具有明显的促进作用，提示耳周间充质具有激活耳蜗毛细胞再生的潜能。本项研究通过胚胎期小鼠耳蜗感觉上皮的体外培养，研究耳周间充质对耳蜗感觉前体细胞增殖和分化的促进作用；利用Math1/nGFP转基因鼠，采用荧光激活细胞分离技术获取支持细胞，为进一步研究耳周间充质对支持细胞增殖分化的影响奠定基础。

我们前期实验表明：在胚胎第12.5天（Ｅ12.5），小鼠耳蜗感觉上皮相邻的间充质能促进耳蜗毛细胞增多。为了进一步明确间充质促进毛细胞形成的原因及增多的毛细胞来源，我们在E12.5 + 6 DIV培养过程中加入6 µg/ml BrdU，以BrdU标记增殖细胞，Myosin 7a标记毛细胞。实验组是带有相邻间充质的感觉上皮，对照组是不带间充质的单纯感觉上皮。结果显示增殖而来的毛细胞：实验组 18.9±2.77；对照组：13.7±2.91。两组之间虽然差异有统计学意义，但结合前期实验结果（实验组的毛细胞数：519.75±98.112；对照组：299.71±23.915），我们认为E12.5耳周间充质能促进耳蜗感觉前体细胞增殖分化为毛细胞，但更主要的是促进耳蜗感觉前体细胞向毛细胞分化。 . 我们在实验中还发现：在胚胎期小鼠耳蜗感觉上皮离体培养中，在Ｅ12.5加入外源性BMP4时可引起毛细胞增多，加入其抑制剂导致毛细胞明显减少。而BMP4从Ｅ12.5主要表达在耳周间充质，我们猜想BMP4可能是间充质中影响感觉前体细胞分化形成毛细胞的主要因素之一。我们检测加入BMP4后Shh和Sox2基因的表达变化(Shh和Sox2是哺乳动物耳蜗感觉前体细胞形成及毛细胞分化的关键调控基因之一)。结果显示：E12.5 + 6 DIV BMP4 20ng 组的Shh mRNA的量仅为对照组的43.7%，Sox2 mRNA的量为对照组的81.2%。同时，Shh信号的下游基因Gli1和Gli2的表达也明显受到抑制，Gli1为对照组的81.0%，Gli2为对照组的69.3%。根据目前初步研究结果，我们认为BMP4促进毛细胞形成可能与抑制Shh、Sox2基因表达有关。. 项目完成情况：基本完成