不同胚层起源骨髓间充质干细胞的Exosome在骨再生中的作用及机制研究

Autologous bone graft is the main treatment method of repairing large mandibular defect, but it is still unclear how embryonic layer origin and donor site influence the effect of bone grafts. We demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) derived from human mandible were superior to those from femur in osteogenic differentiation, which can be regulated by exogenous exosome. In this study, we hypothesized that in the bone graft area, BMSCs from different embryonic layer origin could transfer the key miRNAs through the exosome, regulating the function of BMSCs and bone regeneration. Therefore, this study analyzes the miRNAs of exosome from mandibular and femoral BMSCs, exploring whether osteogenic differentiation of BMSCs could be regulated by the key miRNAs transferred from exosome. Then, through the positive and negative regulation of miRNAs, situ and ectopic osteogenesis animal model, we explore the mechanism of exosome and BMPs-Smad signaling pathway in bone regeneration. This study will deepen the understanding of the role and mechanism of exosome of BMSCs in bone regeneration, and provide a theoretical basis and clinical guidance for the treatment of large bone defects.

自体骨移植是目前修复颌骨大面积缺损的主要治疗方法，但不同供骨部位的自体骨移植效果存在显著差异，其机制尚不明确。申请人前期研究发现，胚层起源影响BMSCs的成骨分化，颅面部骨BMSCs的成骨能力优于四肢骨BMSCs，同时BMSCs的成骨分化受外源Exosome调控。在本课题中，我们推测在植骨区，来自颅面部骨和四肢骨的BMSCs可通过Exosome传递关键miRNAs而相互调控，进而影响自体骨移植的效果。为此，本研究将分析颌骨和髂骨BMSCs分泌的Exosome中miRNAs差异，探寻不同胚层BMSCs如何通过传递Exosome调控BMSCs的成骨分化；通过正性和负性调控miRNAs，原位和异位成骨动物模型，研究Exosome和BMP-Smad信号通路参与调控骨缺损修复的机制。该研究有助于揭示不同胚层BMSCs的Exosome在骨再生中作用，为颌骨大面积缺损的骨移植治疗提供理论依据和临床指导。

由外伤、肿瘤切除、先天性畸形和感染等疾病导致的颌骨大面积缺损是口腔及颅颌面修复治疗面临的一大难题。目前，颌骨大面积缺损的主要治疗方案是骨移植手术，自体骨移植仍是临床治疗的“金标准”。研究表明，颅面部骨移植颌骨愈合快且好，四肢骨移植颌骨却有5%-10%出现愈合延迟，甚至骨不连，需要进行二次手术。目前国内外的主流观点认为来自不同胚层的骨骼的成骨、成软骨方式不同，这可能是影响骨移植愈合的关键原因。目前，受植床微环境如何影响植骨块BMSCs的成骨方式还有待探讨，探究不同胚层骨相互移植愈合差异背后的机制是改善骨移植愈后的关键。本研究构建大鼠颅面部骨和四肢骨相互移植模型，通过microCT、拉曼光谱及Masson、H&E、Goldner、番红固绿等染色评估成骨成软骨等骨愈合情况；构建transwell共培养体系模拟颌骨微环境对四肢骨BMSCs的影响，并使用高通量测序、qPCR，Western blot，茜素红染色来评估四肢骨BMSCs成骨成软骨分化的变化；通过外泌体抑制剂验证外泌体是该调控过程中的关键运输工具；通过高通量测序证实不同胚层来源BMSCs外泌体中miRNA的表达差异，miRNA抑制剂验证miRNA对Hox的调控及对下游成骨、成软骨的影响。结果表明：（1）颅面部骨和四肢骨相互移植存在成骨、成软骨的愈合差异，四肢骨移植颅面部骨后成软骨趋势降低，成骨趋势增强；（2）颅面部微环境通过外泌体促进植骨块BMSCs的成骨分化，抑制成软骨向分化；（3）颅面部骨和四肢骨BMSCs的外泌体存在37种差异表达的miRNA；（4）外泌体中的miRNA调控植骨块BMSCs中的胚层基因Hox的表达，这是成骨、成软骨向分化改变的主要因素。本项目明确受植床微环境中的外泌体miRNA是调控植骨块成骨，成软骨向分化的主导因素，该研究的深入探索有助于为加速移植骨愈合提供新思路，为将来相关组织工程或药物的应用提供理论基础。