粘合蛋白在间充质干细胞肺滞留中的作用

Mesenchyal stem cells (MSC) are the most commonly studied stem cells in clinical trials; however, a significant basic problem has not been resolved, that is the lung entrapment of MSC. After intravenous infusion, currently the most commonly used route of MSC administration in clinical trials, more than 80% of MSC are entrapped in the lungs and die quickly, while only less than 1% of MSC are found in the target organ. The mechanisms of MSC lung entrapment have been unclear. We propose that the expression and activation state of integrins are dysregulated in MSC during ex vivo culture expansion; some integrins are overexpressed and activated. When these MSC enter the capillaries of the lungs, where the blood flows slowly, they adhere to normal (inactivated) endothelia via integrin binding to their ligands on the endothelial cell surface, thus causing obstruction. In this study, we will assess the expression and activation levels of MSC cultured in various conditions. Then we will determine the association of integrin malfunction with MSC lung entrapment, and identify the responsible integrins through functional blockade analysis. We will further verify whether different integrins are involved in MSC lung entrapment and their adhesion and extravasation in the inflamed post-capillary venue. Finally, we will examine whether decreased entrapment of MSC in the lungs is associated with increased engraftment of the cells in the ischemic myocardium and improved therapeutic effect to the infarcted heart. This study will increases current understanding to the molecular mechanisms of MSC lung entrapment and the knowledge learnt from the study will facilitate the development of improved culture methods and therapeutic regimes of MSC.

间充质干细胞（MSC）是目前临床试验研究最多的干细胞。但有一个突出的基础问题没有解决：MSC肺滞留。超过80%的MSC在静脉注射（MSC治疗最常用移植途径）后阻塞在肺毛细血管前，并很快死亡，到达损伤器官的MSC数量极少。解除MSC肺滞留是提高其靶器官到达量的关键。造成MSC肺滞留的原因不清。我们认为，MSC在扩增培养后粘合蛋白的表达和活化状态失常，某些粘合蛋白过表达并处激活状态，使MSC在通过血流缓慢的肺毛细血管时粘附正常的内皮细胞，造成阻塞。我们将分析不同培养条件下MSC粘合蛋白的表达水平和活化状态，并通过粘合蛋白功能阻断等方法，明确粘合蛋白在MSC肺滞留中的作用并找出起关键作用的粘合蛋白，并进一步研究特异性抑制关键粘合蛋白的功能是否减轻MSC肺滞留并增加其到达缺血心肌的数量和对梗死心脏的修复效果。本研究将增加对MSC肺滞留机制的理解，并为改进MSC培养方法的治疗效果奠定基础。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）由于具有多分化潜能，强大旁分泌作用和低免疫原性等优点，成为干细胞治疗多种疾病的首选。MSCs移植为心、脑梗塞等重大疾病的治疗开辟了一条崭新的途径。临床研究证明了MSCs临床使用的安全性，但也遇到了一些亟待解决的问题，其中如何提高MSCs从血液循环进入损伤器官（靶器官）的数量及增强移植修复效果成为突出问题。体外培养的MSCs，在静脉注射后到达靶器官的数量极少，绝大多数细胞不能通过肺循环而滞留在肺，并很快因缺血而死亡，严重影响其对靶器官的修复效果。因此，解除MSCs肺滞留是发挥其迁徙能力、提高其靶器官到达量和更好地发挥其修复作用的关键。然而造成 MSCs 肺滞留的原因和机制并不清楚。本课题采用多种实验方法证实了经体外连续贴壁培养的MSCs 表面的多种整合素如 integrin β1, α5 和 αVβ3 的表达水平都显著升高并明确了阻断间充质干细胞表面的粘合蛋白可以明显降低肺阻塞。另外，本研究通过体外实验筛选出了可能的粘合蛋白，并通过运用小鼠模型证实了MSCs 肺滞留量显著降低的同时伴随着在血液循环中的水平增加，并有更多的 MSCs 迁徙到小鼠心肌梗塞的心脏和耳朵发炎区域。本研究还发现，多次传代贴壁培养的 MSCs 经过我们创新的3D 培养方法培养后，多种整合素的表达水平显著下降，而由钙粘素蛋白形成的介导细胞与细胞连接作用的紧密连接明显增强，细胞内肌动蛋白骨架结构也发生显著变化。这导致细胞体积明显变小，形态变得更为均一，多呈梭形结构且更立体。同时我们的结果显示了3D 培养通过降低骨架张力，增加细胞外囊泡释放的方式减少了细胞体积，增殖能力和迁徙能力提高，多向分化能力增强，同时多能性因子表达升高，尤其降低了Suv39h1 表达水平，增加了干性基因 Nanog 的表达。我们的研究不仅解决了间充质干细胞静脉注射后引起的肺阻塞和动脉注射后引起的微梗塞问题，而且创新了一种间充质干细胞培养的新方法，明显改善了损失组织的移植修复效果，对 MSCs 临床治疗具有重大的科学意义。