大丽轮枝菌参与侵染和致病相关基因的高效克隆及其功能分析

大丽轮枝菌能引起植物黄萎病，严重危害多种重要的经济作物和园艺作物。然而目前对该病原菌侵染和致病的分子机理仍所知有限。本研究拟使用以GFP为报告基因的双向启动子诱捕（Promoter Trap）载体，通过农杆菌介导的方法产生该菌的T-DNA插入突变体库。为更有针对性地找寻目的基因，实验采用了可诱导侵染和致病相关基因表达的植物根提取物培养基。在该培养基上，以GFP荧光观察和潮霉素抗性对转化子进行双重筛选。将有荧光和无荧光的转化子分别建库，并优先对有荧光的突变体库进行致病性鉴定，找出致病性变异的突变体。利用TAIL-PCR、质粒拯救、基因组数据库比对克隆突变基因；依靠基因、蛋白质序列分析，目的基因突变及回补，表达量检测和致病表型等证据揭示这些基因在侵染和致病过程中的作用，为加快新防治药剂的研发和新抗病、耐病作物品种的分子培育提供理论依据和参考。另外，本实验也为提高致病基因筛选效率提供了新的思路。

大丽轮枝菌引起的作物黄萎病是一种严重威胁作物品质和产量的土传病害。目前，控制该病害最为有效的手段就是种植抗性品种。但是，在自然界中，可利用的抗源极为稀少。因此，了解该病原菌的侵染“策略”和“武器”，将有利于推进抗性品种的选育和发掘进度。本项目从正向遗传学入手，利用前期已构建好的双向启动子捕获载体，以菌丝型菌株V07DF2为出发菌株，完成了规模达6000余个转化子的T-DNA插入突变体库的建设，结合棉花根来源的诱导培养基，对部分插入突变材料进行了菌丝生长、菌落形态、产孢数量以及荧光等方面的观察。在1000个转化子中，发现65个转化子具有不同程度的绿色荧光，13个转化子生长表型发生变异，17个转化子致病力丧失或减弱，5个可能影响致病力的基因位点得到鉴定。我们对VdUGPU和VdNUC-2两个基因进行了较为深入的研究。根据启动子捕获报告基因绿色荧光的强弱，发现VdUGPU受到棉花根诱导处理后明显上调表达，同时在定殖棉花的过程中也显著上调表达；该基因的突变体致病力完全丧失，原因可能是影响了大丽轮枝菌对碳源的利用所致。VdNUC-2经证实参与了细胞内无机磷酸盐的感知和吸收，其突变体在低磷酸盐的平板上生长受到明显抑制；同时，与野生型菌株不同，该基因突变体在未预先伤根的情况下，无法正常侵染棉苗，说明磷酸盐代谢途径可能与病原菌穿透寄主根部表皮的能力有关。本项目还解析了菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。由于我们的出发菌株比较特殊，该基因的敲除突变体产生了一种奇特的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。另外，为了能够从反向遗传学角度找到参与致病以及调控重要生物学性状的功能基因，我们将大丽轮枝菌用棉花根提取物处理后，进行了RNA-seq分析。上调超过8倍的基因有60多个，其中有一部分基因的预期产物具有效应因子的特征。我们已在这些基因当中选择潜在的重要基因进行敲除和分析，试图找到更多参与致病相关的基因。在该项目资助期间，发表学报级文章3篇，SCI文章1篇，申请专利2项，同时我们也积累了宝贵的经验和实验材料。随着研究的推进，这些材料必将加深我们对大丽轮枝菌的认知，同时也为黄萎病这一重要的土传病害的控制提供理论指导和依据。