新型非病毒基因载体的可控构建及其运载siRNA的研究

目前，RNA干扰是最有前景的基因治疗方法之一，但是在使用复合型非病毒基因载体运载siRNA时，粒子尺寸和形态不能控制，所以随机性强，难于阐明运载机制，极大地限制了基因治疗的发展。本项目针对siRNA非病毒基因载体难于控制和运载机制不明确的研究现状，综合国内外研究成果和本课题组的研究基础，结合磁性上转换纳米晶的构建可控特性，利用阳离子脂质体易于转染细胞的特点，设计构建一类新型自组装体，用于运载siRNA的研究。从而，获得具有siRNA转运功能和生物探针功能的复合型非病毒基因载体，为基因治疗获得一类新型siRNA转运载体开辟了新思路。通过对自组装体的多层次组装研究，建立可控自组装体的多层组装技术以及粒子尺寸、粒子形态和亚结构分析技术，为该类新型非病毒基因载体的研究提供技术基础。通过该杂化系统的生物探针功能，研究其自解装性能和siRNA转运机制，为复合型非病毒载体运载siRNA提供理论依据。

目前，RNA干扰是最有前景的基因治疗方法之一，但是在使用复合型非病毒基因载体运载siRNA时，粒子尺寸和形态不能有效控制，极大地限制了基因治疗的发展。本项目针对siRNA非病毒基因载体难于控制和运载机制不明确的研究现状，综合国内外研究成果和本课题组的研究基础，结合上转换纳米晶的构建可控特性，利用阳离子脂质体易于转染细胞的特点，设计构建一类新型自组装体，用于运载siRNA的研究。.首先进行了稀土离子Yb3+、Er3+掺杂的NaYF4上转换发光纳米粒子的制备，使用XRD、SEM、TEM、FL和FTIR等手段对上述纳米晶晶型、形貌、发光性质和表面性质进行了分析。结果表明，可得到粒径为25 nm左右的球状颗粒；粒径为50 nm 左右的六方形粒子；长40 nm、直径20 nm左右的纳米棒，形貌不同、晶相结构相同的 β-NaYF4:Yb,Er纳米粒子，在980 nm激光激发下，均显示出良好的上转换发光性能。通过表面配体氧化过程将纳米晶表面的油酸配体氧化为壬二酸，得到了羧基修饰的水溶性纳米晶。通过表面配体交换过程将纳米晶表面的油酸配体转换为柠檬酸三钠，得到具有良好水溶性的上转换纳米晶。.使用合成的一系列阳离子三肽类脂与上转换纳米晶自组装制备复合载体。载体粒径在100 nm左右，Zeta电位在40-60 mV之间，复合载体具有较好的稳定性，经凝胶电泳检测，siRNA可被有效延滞，随着N/P增加，对siRNA的延滞作用增强。经细胞转运研究证明，复合载体可有效运载siRNA沉默luciferase基因的表达，细胞存活率达到80 %以上，与商品试剂Lipofectamine 2000和DOTAP相当。荧光光谱分析表明，复合载体有效进入了细胞中，随着复合载体用量的增加，细胞发光强度也在逐渐增强。证明该复合载体具有较好的基因转运和细胞内发光性能。. 课题研究具有重要意义，上转换发光纳米晶具有背景干扰小、荧光寿命长、对机体损伤小和生物相容性好等优点，在生物领域显示出广阔的应用前景。通过与阳离子脂质体复合使用，构建既具有基因转运功能，又具有生物探针功能的复合载体。可明确该载体进入细胞的路径，追踪各组分在细胞内的分布，为获得一类新型siRNA转运载体开辟了新思路。通过对自组装体的组装研究，建立可控自组装体的组装技术以及粒子尺寸、粒子形态和结构分析技术，为该类新型非病毒基因载体的研究提供技术基础。