用于急性白血病筛查和免疫分型的八色流式细胞术及其数据分析

The multiparameter flow cytometry has become an important method of immuno- phenotyping acute leukemia (AL). In 2015, a group of flow cytometry experts from the branch of Blood Immunology of Chinese Society of Immunology reached a consensus on the immunophenotyping of acute leukemia, and made a set of protocols using four-color flow cytometry. However, more and more flow labs have eight- channel or above flow equipments, the four-color protocols of acute leukemia need to be upgraded to eight-color protocols. New protocols should keep all the merits of the old ones, meanwhile they should take full advantage of eight-color flow machines. With normal individuals as a control group, three case groups of AML, B-ALL and T-ALL are considered. When false discovery rate (fdr) adjustment is applied for multiple comparisons, the sample size is 35 for each group using Monte Carlo method if alpha is 0.05 and beta is 0.2. Besides these training samples, additional 10 individuals for each group are used as test samples. After 180 samples are immunophenotyped via corresponding flow protocols, both simple and complex statistical data analysis are carried out. Training data are used to build up discriminant equations of identifying normal and AL subtypes, then test data are used to assess the models and validate the protocols. Finally, a set of standardized protocols of eight-color flow cytometry for screening and immuno- phenotyping acute leukemia are proposed for clinical use.

多参数流式细胞术（FCM)已经成为检测急性白血病（AL）免疫表型的一种重要方法。2015年，中国免疫学会达成专家共识，制定了检测AL免疫表型的FCM四色方案。随着流式技术的更新换代，一些检验中心和科研结构拥有了多激光多通道流式细胞仪，制定可替代四色方案的检测AL免疫分型的FCM八色方案成为亟待解决的问题。采用四色方案相似结构，八色方案包括筛查、急性髓系细胞白血病、急性B淋巴细胞白血病和急性T淋巴细胞白血病等四个检测部分。八色方案使用八色多管技术。相应地，设计三组病例对照试验。对于多重比较，P值需要做修正。利用蒙特卡洛方法，得到八色方案条件下，各组的样本量均为35。每组10个验证样本。对于骨髓标本流式细胞分析结果，除了传统的统计处理和LAIP分析外，还将根据多面板数据特点进行多变量统计分析提取特征变量和降维，建立统计判别模型，用验证样本对方案进行评价，最后提出一套标准化八色方案供临床使用。

随着流式细胞技术的更新换代，国内急性白血病（AL）流式细胞检测方案正在从四色方案向八色方案过渡。对AL流式数据进行全程自动化分析在国内外都还处于探索阶段。首先，本项目对数据的预处理部分进行了自动化，包括补偿、转换和去粘连和细胞碎片；然后对各流式数据样本的细胞进行聚类形成不同的细胞类，以细胞类的中心位置为宏细胞；随机选取AL病人和正常人的样本的宏细胞在FSC，SSC和CD45三维空间的值的构造训练集和测试集；训练一个类别数为20的有监督的分类模型，并对训练集和测试集所有的宏细胞进行分类。对这20个宏细胞类进行人眼识别，得到9个常见的细胞亚群，比如第1、3、10宏细胞类均为淋巴细胞亚群等，如此完成宏细胞类的标注；最后，利用标注后的细胞亚群，统计各个流式样本的特征，比如各类细胞的比例，某抗原表达的阳性率等，把这些特征值带入训练好的判别准则对病人进行分类（即诊断）；称此技术为“电弧诊断”（ArcDia）。另外，我们还从细胞亚群识别和疾病诊断两个方面，提出了运用神经网络模型实现流式数据自动分析的解决方案，探究将神经网络应用在流式细胞术（FCM）数据分析的可行性。.重要结果：首先，电弧诊断方法（ArcDia）在急性白血病的流式细胞数据自动化分析过程各环节都达到或基本达到专家手工设门分析的应用水平，最终的诊断灵敏度和特异度均高于80%。其次，提出基于FCM数据结构，借助卷积神经网络模型（CNN）实现了AML的自动识别。最后，利用BP神经网络模型实现了对细胞亚群自动区分和识别，很好的复现人工设门的结果，在聚类轮廓上与人设门结果基本一致。.科学意义：本研究创造性的提出了亚群分类和亚群标注自动化方法，架设了样本特征提取和AL自动诊断的桥梁，解决现存流式数据自动化分析方法中细胞的聚类和AML病人的分类两部分内容相互脱节的断联问题，实现流式实验室急性白血病AL分析的全程自动化，为流式实验诊断提供了实用的分析工具,同时神经网络模型的应用也为后续的相关研究提供重要参考。