葡萄转录因子VvWRKY8对白藜芦醇合成酶基因VvSTSs表达的调控机制研究

Resveratrol (Res) is a nonflavonoid polyphenol compound with strong antioxidatIve activity, and it is difficult to meet the market demand for the compound. Grape is one of the few plants which can synthesize resveratrol. Therefore, it is important to explore the biosynthesis of resveratrol in grape in order to increase production. Stilbene synthase (STS) is a key enzyme in the biosynthesis of resveratrol, and it has been reported that the transcriptional factors VvMYB14 and VvMYB15 (with protein sequence identity of nearly 56.2%) can regulate the expression of the stilbene synthase gene VvSTSs in grape. Our previous work indicated that VvWRKY8 may regulate the expression of VvSTSs in grape. In this study, based on the molecular techniques EMSA, ChIP–Seq, BIFC, and gene overexpression or silencing, we attempt to reveal if VvWRKY8 can directly regulate VvSTSs transcription, and which members of VvSTSs are regulated by VvWRKY8 in grape. Then, we clarify the relationship (competition, synergy, or no relationship) between VvWRKY8 and VvMYB14 for regulation of expression of VvSTSs.

白藜芦醇是具有很强抗氧化功能的多酚类化合物，葡萄是少数能够合成白藜芦醇的植物, 是市场白藜芦醇的重要来源。研究葡萄白藜芦醇合成调控机制具有重要意义。芪合酶（stilbene synthase, STS）是白藜芦醇合成的关键酶，在葡萄中目前仅知道VvMYB14和VvMYB15（二者氨基酸序列相似度高）可以直接调控其基因家族VvSTSs一些成员的表达。我们前期研究表明，VvWRKY8可能也与VvSTSs的表达调控有关。本项目以葡萄叶片和悬浮细胞为试验材料，利用染色体免疫共沉淀、双分子荧光互补、基因过量和沉默表达、凝胶迁移率检测等分子生物学技术以及分子动力学模拟手段，首先明确葡萄中VvWRKY8对VvSTSs基因是否有直接的转录调控作用以及调控VvSTSs哪些成员，其次揭示其在调控VvSTSs转录表达的过程中与VvMYB14的关系（竞争、协同或没有关系），初步阐明VvSTSs转录的分子调控机理。

白藜芦醇（resveratrol，Res）属于非黄酮类多酚化合物中的芪类化合物，来源于植物，具有抵抗生物和非生物胁迫的作用。近年来的研究表明，Res具有防治癌症和心血管疾病的作用。然而只有包括葡萄在内的少数植物能够合成并积累Res，而且含量都较低。葡萄是国际上Res的重要来源, 不过目前人们对葡萄Res合成的分子机理了解非常有限：仅从几种植物中分离和鉴定了Res合成的关键酶-芪合酶（STS）基因，也仅明确转录因子VvMYB14和VvMYB15可以直接调控VvSTS的转录。本项目主要研究VvWRKY8对葡萄白藜芦醇合成的调控机制。重要结果如下：1．UV-C辐射处理葡萄成熟叶片，VvMYB14、VvSTSs和VvWRKY8表达水平显著升高，Res含量增加。VvWRKY8蛋白包含1个核定位信号（第83-96位氨基酸残基）和1个WRKY功能域（第110-169位氨基酸残基），属于IIc亚家族。2．VvWRKY8不能直接转录调控VvSTS15/21和 VvMYB14；VvMYB14通过其N端与VvSTS15/21启动子结合并转录激活其表达，不能直接转录调控VvWRKY8表达。VvWRKY8通过其N端与VvMYB14的N端蛋白互作，抑制VvMYB14诱导的VvSTS15/21转录。3．VvWRKY8在葡萄中瞬时和稳定过表达均导致VvSTS15/21和VvMYB14表达量降低,Res积累减少。外源Res的施用诱导葡萄悬浮细胞中VvWRKY8的表达升高，VvMYB14和VvSTS15/21的表达降低。上述结果说明葡萄Res合成存在VvMYB14-VvSTS15/21-Res-VvWRKY8的反馈调节机制：VvMYB14表达上调导致VvSTS15/21表达上调，Res合成增加；Res积累到一定阈值时，VvWRKY8表达增加，其蛋白与VvMYB14结合，导致VvSTS15/21转录水平下降，Res合成减少，从而调节Res在植物体内的含量。这是国际上首次提出Res合成的反馈调节机制，对于培育高Res含量葡萄品种和生物工程生产Res具有重要意义。