唾液乳酸杆菌胆酸盐水解酶的生化特性和功能研究

乳酸杆菌是人体肠道菌群的重要组成部分和人体益生菌的主要来源之一。具有胆酸盐水解酶（Bsh,胆酸降解第一步所需）活性，一直是筛选肠道益生菌的一个重要准则。它不仅是乳酸杆菌在宿主肠道内存活或定植所需的特性，同时也是参与宿主胆汁的生物循环过程并有可能影响宿主物质和能量代谢与调节的一个功能因子。已经证实来源于唾液乳酸杆菌的Bsh是老鼠和鸡肠道内此类酶的主要来源。而对来源于唾液乳酸杆菌的Bsh的初步研究发现，唾液乳酸杆菌可合成两类Bsh酶，它们对不同的共轭胆酸具有不同的亲和力。本研究将考察和比较这两类Bsh降解胆酸的生化特性，分析它们在抵抗胆汁胁迫能力上的差异。然后通过动物试验，运用宏基因组测序与群体分析手段，揭示它们对动物体内脂肪代谢和其肠道菌群组成的影响。此研究成果将有助于进一步揭示Bsh抗胆汁胁迫的机理并对建立Bsh与人体脂肪吸收、代谢类疾病发生率等方面之间的联系具有重要的指导意义。

胆盐水解酶是肠道微生物（尤其是乳酸杆菌）合成的分解胆汁的一类酶。它在降低哺乳动物血液中的胆固醇方面有重要的作用。大多数人体或动物来源的乳酸杆菌都含有一个或一个以上的编码胆盐水解酶的基因。不同菌株来源的胆盐水解酶在生化特性上略有不同。但是目前还没有研究阐明胆盐水解酶与胆汁中不同底物的作用方式和其催化模式，因此在考察益生菌益生特性时，缺乏选择具有特定催化特性胆盐水解酶的依据。.本项目以来源于乳液乳酸杆菌的具有不同底物特异性的两个胆盐水解酶为研究对象，通过考察酶催化反应动力学特性、底物作用特性和酶分子结构对酶催化特性和酶稳定性等的影响，阐明了两类胆盐水解酶的以下生化特性：.（1）BSH1的最适反应pH范围宽于BSH2，并且它的热稳定性及氧化稳定性明显高于BSH2。BSH2对所有结合胆盐的催化效率和亲和能力均高于BSH1；.（2）通过酶反应动力学分析，首次揭示了胆盐水解酶催化反应中的变构特征和酶催化反应的正协同性；.（3）采用等温滴定量热方法分析酶反应的热力学规律，结合酶与产物结合后的二级结构及活性的变化，提出BSH首先识别结合胆盐中的固醇核基团，然后发生酶分子结构和底物特异性变化的酶催化反应机制；.（4）以来源于荚膜梭菌胆盐水解酶的晶体结构为模型，通过同源建模和定点突变发现：BSH1和BSH2酶分子结构中存在不同的底物结合位点；位于疏水腔入口处的底物结合位点不仅与底物特异性有关，而且与BSH的稳定性也密切相关；.（5）采用理性设计结合氨基酸定点突变的方法，证明了唾液乳杆菌胆盐水解酶BSH1中Cys2和Thr264分别是BSH1催化TCA和GCA的关键残基，并对酶的催化活性的保持起关键作用。.项目提出并阐明了两类胆盐水解酶的催化反应机制，对于研究酶的结构与功能具有重要的参考意义。研究结果为揭示和分析BSH在对菌株贡献抵抗胆汁胁迫能力上的差异，探索胆盐水解酶与宿主物质代谢之间的相互影响，为建立胆盐水解酶酶分子结构和催化特性与其生理功能之间的关系提供了有力的理论支持。