生物催化不对称羰基还原胺化反应的探索

手性胺是非常重要的医药、农药等精细化学品的中间体。在诸多的手性胺合成方法中，羰基化合物的不对称还原胺化反应具有很大的吸引力，因为反应的唯一副产物是水，从原子经济学和对环境的影响的角度来看，都具有极大的优越性。但是直接不对称还原胺化反应还是有机合成中的一个重大挑战，现有的方法基本上都是使用胺作为氨基给体，利用NH3作为氨基给体更是有机化学中尚未解决的难题。本项目就是要试图解决这一有机合成中的关键科学问题，在L-氨基酸脱氢酶催化alpha-羰基羧酸的不对称还原胺化生成L-alpha-氨基酸的基础上，发现高选择性的酶催化剂，以NH3作为氨基给体，实现alpha-羰基羧酸不对称还原胺化反应生成光学纯D-alpha-氨基酸，以及beta-羰基羧酸的不对称还原胺化生成光学纯的beta-氨基酸，并研究这些酶的结构与性能的关系，为进一步实现其它类型的羰基化合物不对称还原胺化反应打下坚实的基础。

手性胺是非常重要的医药、农药等精细化学品的中间体。在诸多的手性胺合成方法中，羰基化合物的不对称还原胺化反应具有很大的吸引力，因为反应的唯一副产物是水，从原子经济学和对环境的影响的角度来看，都具有极大的优越性。但是直接不对称还原胺化反应还是有机合成中的一个重大挑战，现有的方法基本上都是使用胺作为氨基给体，在不对称还原胺化后再把胺上的取代基去掉，而利用NH3作为氨基给体则是有机化学中尚未解决的难题。本项目发现来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-二氨基庚二酸脱氢酶是目前报道的第一个具有催化多种2-酮酸还原氨化生成D-氨基酸的野生型meso-二氨基庚二酸脱氢酶，该酶的热稳定性也是目前文献报道中最高的。晶体结构分析表明在Met152的两边形成了两个底物进入通道，天然底物DAP通过其中一个较大的通道进入而发生反应；Met152处于另一底物通道的瓶颈，因而该通道只能通过较小的底物，如D-丙氨酸和丙酮酸。这与已知的该类酶的晶体结构不同，从而揭示了StDAPDH具有特殊底物谱的分子机制，也为设计改造以拓展其催化性能及应用奠定了坚实的基础。研究证明通过对StDAPDH底物L-手性中心周围的氨基酸残基进行设计改造，可以获得不同的D-氨基酸脱氢酶，合成不同的D-氨基酸，从而建立了一个利用氨基酸脱氢酶催化合成D-氨基酸的平台技术。克隆表达了3个不同来源的3,5-二氨基己酸脱氢酶，底物谱分析发现，这些酶对β-氨基酸及β-酮酸没有活性。通过基于L--氨基酸脱氢酶催化机理推测和丙氨酸扫描确定了此酶的催化活性位点。结合模拟结构的结构功能域分析及鉴定的催化活性位点，构建了85个逐点饱和扫描突变库，对这些突变库进行筛选获得对β-homomethionine, β-phenylalanine (β-Phe) 和β-aminobutyric acid具有催化活性的突变体，并首次利用β-氨基酸脱氢酶催化β-酮酸还原胺化合成β-氨基酸。本项目按研究计划达到了研究目标，获得了预期成果。