新型胺脱氢酶催化酮不对称还原胺化的分子机制探索

The asymmetric synthesis of chiral amines from prochiral ketones and free ammonia is considered to be one of the top aspirational reactions.The reductive amination of ketones catalyzed by amine dehydrogenase will play a particularly important role in chiral pharmaceutical industry.Although some amine dehydrogenases have been developed,low activity and narrow substrate specificity restrict their practical application in synthesis of chiral amines.The proposed project plans firstly to investigate the relationship between structre and function of an amine dehydrogenase.Subsequently,using the protein rational design strategy to improve activity and broaden the substrate specificity of the amine dehydrogenase based on the structural information.Finally, the green and efficient biocatalytic processes catalyzed by amine dehydrogenases for the production of various chiral amines are successfully developed.

酮与氨的不对称还原胺化被认为是合成手性胺的最理想反应。而胺脱氢酶催化的该反应因更加绿色，将是未来手性胺合成研究的热点。但目前所报道的胺脱氢酶存在活性低、底物谱极窄的问题，分子改造也因对其结构功能关系不明而无法有效地进行功能强化，严重影响了其在手性胺合成中的应用。针对这一问题，本项目以筛选获得的氨基酸脱氢酶为起始对象，通过定向进化将其进化成对模式酮底物有胺化还原活性的胺脱氢酶，解析该酶及其与底物复合物的三维结构，探索酶与底物结合和催化的关键氨基酸残基，揭示酶结构变化对功能转变的影响规律，阐明其催化的分子机制；其次，利用获得的结构与功能关系，针对不同类型的脂肪族和芳香族酮底物，通过分子对接和分子动力学模拟，探索关键突变位点，对酶进行针对性的理性设计与分子改造，拓展其底物谱，针对不同底物获得相应的高效胺脱氢酶；最后，对其催化反应体系进行系统优化，为手性胺规模化生产构建一个高效绿色的生物催化过程。

手性胺是合成药物活性分子、精细化学品、农用化学品等产品的重要结构砌块，如约40%的手性药物结构中都含有一个或多个手性胺结构单元。目前手性胺的合成主要是以重金属催化的过程为主，这些重金属催化剂不仅价格昂贵还存在严重的环境污染。胺脱氢酶催化的潜手性酮不对称还原胺化合成手性胺的过程不仅理论转化率高达100%，而且可以利用廉价的氨水作为氨供体，所形成的副产物仅为水，具有节能环保、绿色高效等优点，是合成手性胺的最理想途径之一。基于手性胺的重要用途和胺脱氢酶催化合成手性胺的优势，本项目首先通过蛋白质工程技术开发出了15种新型的胺脱氢酶和邻羟基胺脱氢酶，为手性胺和手性1,2-氨基醇的合成创制了高效的酶催化剂，构建了相应的高效酶催化过程；其次，针对胺脱氢酶底物谱较窄的问题，基于胺脱氢酶结构-功能关系和计算机辅助分析，确定了酶活性口袋中影响酶与大位阻底物结合的关键残基(Ala113与Thr134)，通过将其突变成分子最小的甘氨酸，实现了对口袋的“裁剪”，拓展了活性口袋的“容积”，获得了底物谱显著拓宽的胺脱氢酶突变体，拓展了胺脱氢酶在手性胺合成中的应用范围；最后利用创制的胺脱氢酶，开发了胺脱氢酶与醇脱氢酶偶联的双酶“借氢”级联反应体系，实现了在不额外添加还原剂条件下由廉价外消旋醇到手性胺的转化；同时，针对(R)-选择性ω-转氨酶胺化过程中需要使用昂贵D-氨基酸供体的问题，开发了胺脱氢酶/ω-转氨酶/甲酸脱氢酶的级联催化反应系统，实现了以无机氨作为初始氨基供体，由潜手性酮到手性胺的合成。研究成果克服了以往手性胺合成过程中的工艺繁琐、成本高、环境污染等问题，对发展更加绿色环保和节能减排的手性胺合成工艺具有重要示范作用和推广应用价值。