β-氨基酸脱氢酶多样性、底物识别及立体控制机理的研究

β-Amino acid dehydrogenases catalyze the reductive amination of β-keto acids, offering a very promising green approach to the synthesis of optically pure β-amino acids. However, the only known β-amino acid dehydrogenase is 3,5-diaminohexanoate dehydrogenase, which is only active toward its native substrate, 3,5-diaminohexanoate. In addition, the substrate recognition and stereocontrol mechanism of this enzyme, and its synthetic application has hardly studied. In this project, new β-amino acid dehydrogenases will be discovered by genome mining and functional screening of metagenomic libraries. The catalytic properties of the obtained enzymes will be studied. The diversity of β-amino acid dehydrogenases and the synthetic and metabolic pathway of β-amino acids in the nature will be explored. The crystal structures of β-amino acid dehydrogenases and their complexes with substrate and/or co-factor will be analyzed. With structural information at hand, molecular modeling, enzyme-substrate docking, dynamic calculation and site-directed mutagenesis will be performed to study the interaction between protein and substrate, and to understand the substrate recognition and stereocontrol mechanism of these enzymes. Several pharmaceutically important β-amino acids will be selected as target molecules, and semi-rational design and screening of β-amino acid dehydrogenase will be carried out to obtain the highly active and enantioselective mutant enzymes for the synthesis of the target molecules, thus laying a solid foundation for developing new green synthetic methods of optically pure β-amino acids.

β-氨基酸脱氢酶催化β-酮酸的不对称还原胺化反应是合成光学纯β-氨基酸具有前景的绿色方法之一，但已知的野生型β-氨基酸脱氢酶只有3,5-二氨基己酸脱氢酶，且只对天然底物3,5-二氨基己酸有催化活性，人们对β-氨基酸脱氢酶的底物识别和立体控制等催化机理了解很少，这也限制了其合成应用。本项目将在我们已有的研究基础上，采用基因数据分析和宏基因组筛选的方法，寻找新类型的β-氨基酸脱氢酶，并研究它们的催化性质，拓展我们对自然界中存在的β-氨基酸脱氢酶以及β-氨基酸合成和代谢途径的认识；研究β-氨基酸脱氢酶及其突变酶与底物（或底物类似物）和辅酶结合的配合物的晶体结构，结合分子模拟、动力学计算和定点突变等方法来研究蛋白质与底物的相互作用，认识它们的底物识别和立体选择性控制的分子机理；在此基础上进行设计改造，获得高活性高立体选择性的β-氨基酸脱氢酶，建立高效的光学纯β-氨基酸绿色合成新方法。

手性β-氨基酸是合成许多复杂药物分子、生物活性物质的重要砌块，在医药、化工等领域具有重要的应用价值。β-氨基酸脱氢酶催化β-酮酸的不对称还原胺化反应是合成光学纯β-氨基酸具有前景的绿色方法之一，但已知的野生型β-氨基酸脱氢酶只有3,5-二氨基己酸脱氢酶，且只对天然底物3,5-二氨基己酸有催化活性，人们对β-氨基酸脱氢酶的底物识别和立体控制等催化机理了解很少，这也限制了其合成应用。本项目挖掘了不同来源的23个3,5-二氨基己酸脱氢酶基因，研究了重组蛋白的催化性质和底物谱，初步探索了这类酶的分子多样性。成功解析了来源于Candidatus Cloacamonas acidaminovoran的3,5-二氨基己酸脱氢酶的空晶结构、与辅酶NADPH的复合体结构、突变体E310G/A314Y与NADPH的复合物结构、以及突变体E310G/G323S与辅酶NADPH的复合体结构，揭示了这类酶的结构特征，以及它们与β-氨基酸脱氢酶结构的相似性和不同特点。通过量子化学计算和定点突变研究，揭示了酶分子与底物及辅酶NADPH的相互作用，阐明了3,5-二氨基己酸脱氢酶底物特异性的分子基础及催化反应机理。以(R)-β-高甲硫氨酸为模式底物，通过重建辅酶酰胺基团与附近残基的氢键相互作用，成功获得了催化活性提高的突变体E310G/G323S，通过分子改造重塑底物口袋，获得了对(R)-β-高甲硫氨酸活力提高了18000倍突变体。获得的β-氨基酸脱氢酶突变体具有良好的立体选择性，通过不对称还原胺化β-酮酸或动力学拆分β-氨基酸消旋体方法，制备获得了脂肪族和芳香族光学纯β-氨基酸。为进一步研究β-氨基酸脱氢酶的底物识别、立体控制及催化机理，针对目标β-氨基酸的新酶设计，获得高效β-氨基酸脱氢酶催化剂奠定了坚实的理论基础，从而开辟了绿色不对称合成β-氨基酸的新途径。