芳香羧酸脱羧酶催化C-H键活化及二氧化碳固定化的研究

Aromatic C-H activation is one of the great challenges in synthetic organic chemistry.Fixation of carbon dioxide is very important because it convert the waste to valuable chemicals and reduce its greenhouse effect.Aromatic carboxylic acid decarboxylases catalyze the reversible decarboxylation of the carboxylic acids and the carboxylation of aromatics. However, in all cases, the equilibrium heavily favours the decarboxylation,which could not be applied in the synthesis of valuable aromatic carboxylic acids from aromatics and carbon dioxide.In this project, aromatic carboxylic acid decarboxylase genes of different origins will be obtained by genome mining, cloned and expressed in E. coli. The recombinant enzymes will be purified and biochemically characterized. They will be tested with a series of substrates with diverse structural features to explore the relationship between the substrate and the thermodynamic equilibrium of the reaction. Crystallization of these enzymes will be investigated to obtain the crystals and study their structures, in an effort to understand the substrate binding and catalytic mechanism of the enzymatic reactions, thus to identify the key amino acid residues and structural features which greatly affect the thermodynamic equilibrium of the reversible decarboxylation and carboxylation. Based on these knowledges and understanding, an aromatic carboxylic acid decarboxylase will be selected for further rational engineering to afford enzymes, which catalyze efficient C-H activation of aromatics and fixation of carbon dioxide to synthesize aromatic carboxylic acids of high value.

芳香烃的C-H键活化生成官能化合物是有机合成化学的重大挑战之一，工业废气CO2的固定合成有价值的有机化合物对于绿色生产至关重要。芳香羧酸脱羧酶（羧化酶）催化可逆的芳香羧酸脱羧反应和芳香烃的羧基化反应，然而已知的芳香羧酸脱羧酶的平衡都严重倾向于脱羧反应方向，不利于芳香烃羧基化，合成有价值的芳香羧酸类化合物。本项目将采用基因克隆或基因合成的手段获得不同来源的芳香羧酸脱羧酶，研究苯环上具有不同取代基的底物与它们催化可逆反应的热力学平衡之间的相互关系，培养得到这些脱羧酶的晶体并解析其分子结构，或者建立合适的模拟结构，从分子水平研究芳香羧酸脱羧酶（羧化酶）与底物的相互作用机制和催化反应机理，了解该类酶中影响其催化反应平衡的关键氨基酸位点和结构因素，在此基础上对芳香羧酸脱羧酶进行设计改造，获得能够高效催化芳香烃C-H键与CO2反应生成有机酸的酶催化剂，实现芳香烃C-H键活化及CO2固定。

芳香烃的C-H 键活化生成官能化合物是有机合成化学的重大挑战之一，工业废气CO2 的固定合成有价值的有机化合物对于绿色生产至关重要。芳香羧酸脱羧酶（羧化酶）催化可逆的芳香羧酸脱羧反应和芳香烃的羧基化反应，然而已知的芳香羧酸脱羧酶的平衡都严重倾向于脱羧反应方向，不利于芳香烃羧基化，合成有价值的芳香羧酸类化合物。本项目通过基因数据库挖掘获得了六个不同来源的芳香羧酸脱羧酶，克隆、表达、分离纯化了这些酶，并研究了它们的酶学性质。研究了它们对带有不同取代基的水杨酸的催化特性，发现不同的取代基、取代基的不同位置对酶活都有显著的影响；同时研究了它们对于酚类底物的羧基化反应，发现不同的取代基、取代基的不同位置对于酚类化合物的羧基化反应也有显著的影响；测定了苯酚类化合物羧化反应的动力学参数和平衡常数，不同的取代基对羧化反应的平衡常数有明显的影响。解析了来源于Fusarium oxysporum和Aspergillus oryzae的2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的晶体结构，研究了其催化机理。通过底物与苯甲酸脱羧酶晶体结构的对接计算，分析了控制脱羧反应和羧基化反应平衡的关键氨基酸位点，通过对这些位点的氨基酸进行突变改造，获得了有益的突变体，并研究了这些突变酶的催化性质。首次发现了芳香羧酸脱羧酶催化苯硼酸的脱硼酸反应，并研究了芳香羧酸脱羧酶及苯硼酸的结构对催化活性的影响。通过向羧化反应体系中加入四级胺沉淀剂，将产物水杨酸沉淀出来，降低逆反应速度，推动可逆反应向羧化方向进行，首次实现羧化反应转化率达到97%，从而有效地固定二氧化碳，高效合成了重要的农药中间体2，6-二羟基苯甲酸等有机酸化合物。实现了温和条件下酶催化的科尔贝-施密特（Kolbe-Schmitt）反应，为二氧化碳固定及有机芳香酸的绿色合成提供了新的途径。